159400. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izohemantitest meghatározásra alkalmas, szolubilizált lipofil festékkel jelzett, vörösvértest strómát és szubcelluláris fehérje frakciót koncentráltan tartalmazó liofilizált készítmény előállítására

5 159400 e zül a legfontosabb mukoid receptorokat szabadon hagyja. Választásunk azért, a közömbös lipofil festékek csoportjára esett. A lipofil festékek hidrofób tulajdonságainál fogva nem vízoldékonyak, viszont a stroma festésére az antigenitás megtartása érdekében csak vizes közeget alkalmazhatunk. Kielégítő szolübilizálhatósága a „Szudán-feketét" (Sudan black B: Benzol-azo-naftol-azo~l,3-dihidro-2,2-<dimetil-perimidin; Kolor index száma 26150) tette alkalmassá stroma festésére. A „Szudán-fekete" vizes közegben való oldásának elősegítésére a micellaképzésen alapuló vizes oldást választottuk. Szolubilizálószerként Sor-boxaethenum oleinicumot (V. N. Tween 80) alkalmaztunk. Bár a Tween 60 a Tween sorozatban erősebb lipofil jelleget mutat, alkalmazását kizárja az a körülmény, hogy alacsonyabb HLB értékénél fogva (14,9 illetve Tween 80: 15,0) már nem szolubilizálószer. Emellett a Tween 80 előnyös fizikai tulajdonságokkal rendelkezik, szobahőfokon folyékony, felületaktív, a „Szudán-feketével" nem kívánatos reakcióba (kicsapódás, színváltozás) nem lép. (Kedvessy: „Gyógyszertechnológia" 1965/156—161. Medicina Budapest.) Vizes közegben megfelelő feltételek betartása mellett a stroma és a reverzibilisen kicsapódott strukturfáhérjék intenzív kék színre festődnek, gyártástechnológiai szempontból nézve gazdaságosan ülepíthetők. A fölös festék kimosása után visszanyert üledék minden hasznos anyagot tartalmaz, +4 C°-on megfelelő stabilitást mutat, 2%-os konyhasó oldatban vagy makromolekuláris közegben bármikor, maradék nélkül homogenizálható. Az üledék liofilizálható technológiai alapanyagot képez, ami a- tartósításnak, forgalomba hozatalnak alapfeltétele. Gyártástechnológiai és forgalmazási szempontból lényeges követelmény a készítmény liofilizálása. A dextrán-albumin oldószer elegy előnye, hogy a liafilizált készítmény ebből a hordozó közegből desztillált vízzel gyorsan, maradék nélkül visszaoldható, s a szuszpenzió eredeti agglutinábilitását megtartja. Készítményünk biológiai sajátságaiból következően a liafilizálás .során alapvető követelmény a —40 C°tól +37 C°-ig terjedő hőmérsékleti tartomány szigorú megtartása. Az előállított anyag Rh— Hr tulajdonságai 56 C°-on inkubálva például elroncsolhatók. A liofilizált készítmény stabilitása megfelelő, •a készítmény reakciókészsége és aviditáca a friss natív vörösvértest szusapenzióéval közel egyenértékű. Vízoldás után +4 C°-on tárolva legalább 3 napig szavatoltan felhasználható. Az eljárás lehetőséget biztosít liofilizált izohemantitesteket és vörösvértest antigén standardot tartalmazó, hosszú lejárati idővel előregyártható tipizáló egység előállítására is. Eljáráshoz felhasznált anyagok: 1. választott vörösvértest massza 2. 0,9%-os konyhasó oldat 3. 37 C°-ra előmelegített desztillált víz 4. Sudan black (E. Gurr London S. W. 14) 5. Sorboxaethenum oleinicum (Pharmacologica Hungarica VI) 6. Human albumin (25%) 7. Polyglukin (6% — USSR) Eljárás: A nagy szériából kiválasztott, 21 napnál nem idősebb, megfelelő agglutinábilitású O, A és B csoportú plazmamentesített vörösvértest maszszát 0,9%-os konyhasó oldattal addig mossuk, míg a felülúszóban 5%-os triklórecetsawal vizsgálva fehérjét legfeljebb már csak nyomokban találunk. A mosott vörösvértest masszát 1:25 arányban 37 C°-ra előmelegített desztillált vízbe öntjük folyamatos kevergetés közben. A hemolizátumot 60 percig (megengedett eltérés: ±20%) szobahőn ülepítjük, majd az üledéket 25 000 g-vel (megengedett eltérés: ±20%) 5 percig centrifugáljuk. A finom, krémszerű üledéket legalább háromszor — 1:25 arányban hígítva — desztillált vízzel mossuk. A nyert üledékhez súlyával egyenlő mennyiségű festék törzsoldatot adunk. A festékes elegyet körülbelül 15 percig rázógépben, vagy keverőlapátos ballonban reszuszpendáljuk, és 36—48 órán át +4 C°-on inkubáljuk. A megfestett szuszpenziót térfogatához viszonyított tízszeres mennyiségű desztillált vízzel kicsapjuk, majd ülepítés után 25 000 g-vel (megengedett eltérés: ±10%) centrifugáljuk. Az üledéket liafilizálás előtt 2,5% Human albumint és 3% dextránt tartalmazó vizes közegu oldószerben oldjuk. Az üledék — oldószer súlyaránya 1:1 (aa. partes). A liofilizálás szokásos technológiával, héjfagyasztás után — 40 C°-tól +37 C°-ig terjedő hőtartományban végezhető. Eljárás a festék törzsoldat készítésére: 4 térfogat desztillált vízhez 1 térfogat koncentrált sorboxaethen oldatot adunk, (előhígítás) majd enyhe melegítés közben oldódásig keld 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A festett készítmény agglutinációt aktiváio sós, vagy makromolekuláris közegben (Eldon: „Gleichzeitige ABO- und RH-Blutgruppenbestimmung auf Karten." — Im Laboratorium 45 oder am Krankenbett — 1955. Kopenhagen) könnyen homogenizálható körülbelül 10 térfogat %-nyi agglutinogen komplexet tartalmaz. Vizsgálataink szerint a festett stroma szuszpenzió oldására az albumin-^dextrán tartalmú vizes .. oldat a legalkalmasabb. 3