159088. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parcialisan dezaminalt L-aszparaginaz előállítására
3 159088 4 A salétromossav, illetve salétromossavat szolgáltató vegyület mennyisége az alkalmazandó L-aszparagináz mólsúlyától függ. Általában 1 mól L-aszparaginázra kb. 5—180 mól, előnyösen 40—80 mól salétromossavat használunk. A beadagolt L-aszparaginázt általában olyan mértékben dezamináljuk, hogy a közvetlenül a van Slyke-féle módszerrel és-vagy ninhidrinreakcióval meghatározható nitrogén még a kiinduló érték 30%-a, előnyösen 70—90%-a. A dezaminálás fokát a reakcióhőmérséklet változtatásával könnyen szabályozhatjuk, mini ellett a reakciót a szokásos módon, például legalább sztöchiometrikus mennyiségű karbamid hozzáadásával vagy a pH-érték 7 fölé emelésével fejezzük be. A pH-érték emelésére a szokásos szervetlen bázisok, előnyösen alkálifém(különösen nátrium- vagy kálium-) és alkáliföldfémhidroxidok (különösen magnézium-, kalcium-, báriumhidroxid) hígított oldatait használhatjuk. Általában előnyös, ha az L-aszparaginázt az oldószerre számítva kb. 0,1—15 súly%, előnyösen 3—10 súly% koncentrációban adagoljuk. Általában —30 °C és +20 °C közötti, előnyösen 0 °C és 5 °C közötti hőmérséklettartományban dolgozunk. A szabaddá tett nitrogén által okozott habzás elkerülésére adott esetben előnyös lehet, ha felületaktív anyagot adunk az elegyhez. Felületaktív anyagként a trialkilfoszfátok, például tributilfoszfát mellett még a szokásos anyagokat, így például az n-butanolt, izoamilalkoholt, oktilalkoholt, szilikonolajokat nevezzük meg. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint az eljárást valamely vízben oldható nukleofil akceptor jelenlétében valósítjuk meg. Alkalmas akceptor az összes teljesen vagy részben vízben oldható aromás vegyület, ha nukleofil centrummal rendelkezik, 1% alatti vizes oldatban nem okozza az enzim denaturálódását és nem kötődik erősen a proteinhez. Ilyen akceptorok például a fenolok, szubsztituált fenolok, fenilkarbonsavak, fenilszulfonsavak, aromás alkoholok, naftolok stb. Ezeken az aromás akceptorokon kívül alifás telítetlen vegyületeket, például poliéneket, karotint és karotinoidokat is sikeresen alkalmazhatunk akceptorként. A fenti akceptorokat 0,1—10 súly% menynyiségben adjuk a dezaminálandó L-aszparaginázhoz. Az akceptorokat az enzimtől polietilénglikollal végzett tisztítással, adott esetben aktív szénnel és/vagy Kieselguhr-ral és/vagy alumíniumoxiddal végzett utókezeléssel távolítjuk el. Míg az ismert L-aszparaginázok a betegeken időbeli szempontból nem kielégítő szérum-tükröt okoznak, a találmány szerinti eljárással előállítható, parciálisan dezaminált, új L-aszparaginázok azzal tűnnek ki, hogy vérben való tartózkodásuk ideje lényegesen hosszabb és egyidejűleg a szérum-tükör magasabb. Az új vegyületek ugyanolyan enzimaktivitást mutatnak, mint a kiindulási vegyületként alkalmazott hiteles L-aszparaginázok. A hiteles L-aszparagináz-minta biológiai felezési ideje vérszérumban kb. 15—20 óra. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárással kapott, legfeljebb 5—30%-ig dezaminált L-aszparagináz biológiai felezési ideje 24—31 óra. Az új L-aszparaginázok szemben az ismertekkel elektroforézis esetén nagyobb vándorlási sebességet mutatnak az anód felé. A találmány szerinti eljárás megvalósítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 10 g, kb. 180 egység/mg anyag tisztaságú L-aszparaginázt 70 cm3 vízben feloldunk. (Egy egység L-aszparagináz az a mennyiség, amely 7,2 pH-értéken és 37 °C-on egy perc alatt L-aszparaginból 1 fimól ammóniát hasít le.) Hozzáadunk 500 mg nátriumnitritet, és az oldatot 0 °C-ra hűtjük. Lehűlés után a pH-értáket 1 n esetsavval 5-re állítjuk be, és ezt az elegyet 0 °C-on kb. 12 órán át keverjük. Ha a nitrogénfejlődés miatt erős habzás lép fel, ajánlatos, ha néhány csepp tributilfoszfátot adunk a reakcióelegyhez. Ezután karbamiddal frakcionált kicsapást végzünk az oldatból oly módon, hogy a reakcióelegyhez 40 térfogat% vizes polietilénglikololdatot (mólsúly 1550) adunk, amely 50 súlyrész polietilénglikolból és 50 súlyrész vízből áll és az elegyet 30 percen át keverjük. Az így keletkező csapadékot hűtőcentrifugán elválasztjuk, a felső réteget eldobjuk. A kapott csapadékot jéghideg acetonban diszpergáljuk és újra centrifugáljuk. Ezt követően a keletkező csapadékot vákuumban kb. 25 °C-on szárítjuk. A kapott, parciálisan dezaminált L-aszparagináz az eredeti aminonitrogénmennyiség 90%-át tartalmazza. Kitermelés az elméleti kitermelés 80—90%-a. Az 1. példa szerinti módon eljárva az alábbi parciálisan dezaminált vegyületeket kapjuk: nuineríviaraséklet (°C) Wltnt W) dék N ( o/ o) 2 4 0 1,5 90 60 3 12 4 0,5 70 4 6 4 1,5 70 Összehasonlítható eredményeket kapunk, ha a reakciót oldószerek jelenlétében valósítjuk meg. 53 Kitermelés az elméleti kitermelés 80—90%-a. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 !>,•> 9
