158742. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 18 631 R. P. antibiotikum előállítására
17 158742 IS Miután a pH-t 1400 ml 10 n nátronlúg hozzáadásával 7,80-ra állítottuk be, hozzáadunk 2 kg kalciumkarbonátot, majd 122 C°-on 40 percig steriliziäljuik. A lehűlés után 355 liter térfogatú fermenttahez hozzáadunk 40 liter 10 Ikg cerelózt tartalmazó steril vizes oldatot és 5 liter 800 g ammóniumszulfátot tartalmazó steril vizes oldatot. Ekkor a pH 6,90. Ezután a közeget a 170 literes fermentorfoól vett 40 liter inokuium tenyészettel beoltjuk. A tenyésztést 71 óra hosszat végezzük 30 C°^on percenként 260 fordulatú keverővel keverve és óránként 25 m:! steril levegővél levegőztetve. Ekkor a fermentlé pH-ja 7,7 és térfogata 410 liter. A jelenlévő antibiotikum mennyisége 5 jxg/am-''. 3. példa: A 2. példában leírt körülmények között előállított, 5 ftg/om3 titerű 930 liter fermentlevet betoltunk egy keverővel ellátott tartályba. A fermentlé pH-ját 12,6 liter 5 n sósavval beállítjuk 5 értékre. Fél órai keverés után hozzáadunk 50 kg szűrést e'lŐEegítő anyagot, és a szuszpenziót szűrőprésben leszűrjük. A szűrőlepényt 200 liter vízzel mossuk. A 960 liter szűredéket elvetjük. A 196 kg szűrő'.epényt keverés köziben 400 liter metanolt tartalmazó 500 liter víz-metanol elegyben szuszpendáljuik. Ezután a keverék látszólagos pH-ját 10 n nátronlúg hozzáadásával 7 értékre állítjuk be. A keverést fél óra hosszat folytatjuk, majd a szuszpenziót szűrőprésen megszűrjük. A szűredéket felfogjuk, és a szűrőlepényt 60 tériogat% metanolt tartalmiazó 150 liter víz^metanol eleggyel mossuk. A szűredék és. a mosóvíz együttes térfogata 665 liter, titare 5,7 /ig/cm3 . A szűrőlepényt elvetjük. Az alkoholos szűredéket 35 torr nyomás alatt 35 C°-on 80 liter térfogatra koncentráljuk. A kon.centrátumot keverővel ellátott tartályba öntjük, hozzáadunk 40 liter nibutanolt, és a vizes fázis pH-ját 5 n sósavval 3-ria állítjuk be. A keverést 30 percig folytatjuk, majd a felső fázist defcantálással elválasztjuk. Az extriakciót 40 liter n-ibutanollal meg-, ismételjük. A kivont anyalúgot elvetjük. A két kivonatot (102 liter) egyesítjük, és 10 liter vízzel mossuk. A mosóvizet elvetjük. A butanolos oldatokat 20 torr nyomás alatt 37 C°^on 3 liter térfogatra koncentráljuk. A koneentrátumot nátriummetilátnak 25%-os n-butanolos oldatával 7 pH-ra állítjuk be. A közömbösített koncentrátumhoz 30 liter hexánt adva az antibiotikumot kicsapjuk, szűrőn elkülönítjük, hexánnal mossuk, és 40 C°-on 5 torr nyomás alatt szárítószekrényben megszárítjuk, így 375 g nyers 18 631 RP antibiotikumot kapunk 8,5 /xg/mg titerrel. 4. példa: Az 1. példában leírt fermentációból származó 10,5 liter fermentlevet beöntünk egy keverővel ellátott tartályba. Hozzáadunk 1-0,5 liter n-butanolt és 500 g szűrést elősegítő anyagot. A szuszpenziót fél óra hosszat keverjük, és le-5 szűrjük. A szűrőlepényt 1 liter n-butanollai, . majd 1 liter vízzel mossuk. A szűredéket dekantáljük, az alsó vizes fázist elkülönítjük, és elvetjük. Az 1 liter szerves fázist 40 torr nyomás alatt 30 C°-on 200 cm3 térfogatra koncentráljuk. 10 A jelenlevő antibiotikumot 2 liter hexánnal kicsapjuk. Az antibiotikumot szűréssel elkülönítjük, hexánnal mossuk, és szárítószekrényben 40 torr nyomás alatt 30 C°-on megszárítjuk. így 14 g nyers antibiotikumot kapunk 3 ^g/mg 15 titerrel. A nyers terméket 7 pH-jú M/3 foszfátpufferoldattal impregnált Arches 302 papíron, kifejlesztő oldatként kloroformmal kromatografáljuk. Ugyanolyan elmozdulást tapasztalunk, mint 2Q az S. albocinerescens DS 21 647 tenyészetből elkülönített nyerstermék esetében (3. példa, Rf = = 0,5). -Arches 302 papíron, vízzel telített 1 : 1 arányú etilacetát-ciklohexán eleggyel mozgó fázis-25 ként, ugyanaz az elmozdulás tapasztalható, mint az S. aiboeinerescens DS 21 647 tenyészetből elkülönített nyerstermék esetében (3. példa, Rf = = 0,5). Szilikagél G vékonyrétegen 90 : 6 : 6 arányú . széntetraklorid-etanol-ecetsav eleggyel kifejlesztő rendszerként ugyanolyan elmozdulást tapasztalunk, mint az S. albocinerescens DS 21 647 tenyészetből elkülönített nyerstermék esetében (3. példa, Rf = 0,5). 35 5. példa: A 2. példa szerint készült, de 1 /xg/ml titerű és 7,1 pH értékű 480 liter fermentlevet töltünk 40 keverővel ellátott tartályba. Hozzáadunk 400 liter etilaoatátot, majd V2 órai keverés után 45 kg szűrést elősegítő anyagot. A szuszpenziót szűrőprésen megszűrjük, a szűrőlepényt 80 liter etilacetáttal, majd 150 liter vízzel mossuk. A . kapott 1080 liter szűredéket dekantáljuk. Az alsó D vizes fázist (680 liter) elválasztjuk, és kiontjuk. A 420 liter szerves fázist 40 liter vízzel mossuk. A mosott kivonatot 60 torr nyomás alatt 22 C°--on 3 literre koncentráljuk. A koncentrátumhoz 30 liter hexánt adva az antibiotikumot kicsapjuk, szűréssel elválasztjuk, »hexánnal mossuk, és vákuumszárítószekrény.ben 5 torr nyomás alatt 40 C°-on megszárítjuk. így 37 g nyers 18 631 RP antibiotikumot kapunk 6 ug/mg titerrel. 55 6. példa: A 3. példa szerint kapott, de 5,8 /xg <mg titerű 1478 g nyersterméket feloldunk 12 liter 1:1 60 térfogatarányú metanol-wíz elegyben. A kapott 7,0 pH értékű oldatot felöntjük egy 15 cm belső átmérőjű, 25 liter kloridfázisban levő Dowex 1X2 gyantát tartalmazó oszlopra, 3 liter/óra ji5 kifolyási sebességet beállítva. 9
