158691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás veszettség elleni oltóanyag előállítására

3 158691 4 hatunk elő úgy, hogy a tenyészethez felhasznált sejtekkel kompatibilis, Pasteur-típusú fixáit vírustörzsből indulunk ki. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy Flury H.E.P. típusú módosított vírustörzseket alkalmazunk, s ekkor élő oltóanyagot kapunk. A-találmány szerint a vírus tenyésztésére felhasználható sejttenyészeteket menyétfélék (Mustelidéae), előnyösen rágcsálók, mint egér, patkány vagy hörcsög szerveinek utódsejtjeiből kaphatjuk. A sejteket az állatok különféle szerveiből, így pl. a bőrből, tüdőből vagy a veséiből nyerjük. A találmány szerint pl. BHK vagy NIL jelű utódsejteket, vagy egyéb, pl. hörcsög veséjéből, előnyösen fiatal hörcsög veséjéből származó utódsejteket alkalmazhatunk. Az eljárás megvalósítása során különös gondot kell fordítani a vírustörzsek és a sejtek összeegyeztetésére, amelyeken a tenyészetet fejlesztjük. A találmány szerint táptalajként pl. aminosavakat, vitaminokat, cukrokat és szérumot tartalmazó izotoniás sóoldatot — mint pl. Stocker—McPherson-táptalajt — alkalmazhatunk. A vírustenyészetet táptalajban, seitszuszpenzión fejleszthetjük, azonban üvegfalon, álló vagy forgó lombikban fejlesztett tenyészetet "is felhasználhatunk. A tenyésztést előnyösen süllyesztve forgó lombikban végezzük. A találmány szerint a tenyészetet egyetlen táptalaj felhasználásával állíthatjuk elő. A tenyésztési idő kb. 72—96 óra, 34—38 C°-os hőmérsékleten. A találmány szerinti eljárás különösen előnyös foganatosítási módja szerint a tenyésztést szérumtartalmú táptalajban kezdjük, amelyet pl. kb. 48 óráig 34—38 C°-on tartunk, majd a tenyésztést egy második, szérummentes táptalajban folytatjuk, amelynek térfogata az első táptalajénál lényegesen kisebb, pl. az első táptalaj térfogatának tizedrésze. A második, szérummentes táptalajon a tenyésztést pl. 24—28 órán át végezhetjük, így a tenyésztés összideje 72—96 óra. A tenyésztési táptalajhoz adott szérumnak természetesen a sejtekkel kompatibilisnek kell lennie. A találmány szerinti eljárás további előnyös foganatosítási módja szerint a rendszer pH-ját a tenyésztés kezdetén a táptalajiba vezetett megfelelő mennyiségű széndioxiddal optimális, 7 körüli értékre állítjuk be. ' A tenyésztés befejeztével a sejtekét szokásos módon megfagyasztjuk, majd ismét felolvasztjuk, s ezután egy folyadékban — célszerűen a tenyésztési táptalaj fedőfolyadékában — szétaprítjuk. Az elegyet végül a sejtmaradékok eltávolítása céljából centrifugáljuk. Ha legyengített vírus-alapú oltóanyagot kívánunk előállítani, az oldathoz előnyösen 1 :1000—1 : 6000 hígítású /?-propiolakton inaktiválószert adunk. Az inaktiválást pl. 0—37 C° közötti hőmérsékleten, néhány óra — néhány nap időtartani alatt végezhetjük. 1 :5000 térfogatrész hígítású /J-propiolakton felhasználásakor 0 C°-on 24 óra alatt általában megfelelő inaktiválást érhetünk el. Hasonló 'eredményeket - érünk el, ha 1 : 5000 hígítású p'-propiolaktonnal 18 C°-on 16 órán át végezzük a kezelést. 1 : 2000 hígítású //-propiolakton alkalmazásával a vírusokat 25 C°-on 3 óra alatt inaktiválhatjuk, s ugyanilyen hatást érhetünk el, ha a kezelést 37 C°-on 2 órán át 1 :4000 hígítású /S'-propiolaktonnal végezzük. A találmány szerinti eljárásban inaktiválószerként előnyösen '/?-propiolaktont alkalmazunk. Az eljárás így könnyen reprodukálható, és megbízható eredményeket kapunk. Előnyösen járunk el úgy, hogy a kész oltóanyagot szokásos módon fagyasztva szárítjuk.. Egy másik, előnyös kiviteli változat szerint az oltóanyaghoz a liofilizálás előtt, vagy felhasználáskor az oltóanyag hatásának fokozására alkalmas segédanyagokat tartalmazó folyadékot adunk. Ilyen segédanyagokként pl. olajat, mint ásványolajokból álló, „Drakeol" néven ismert segédanyagot, vagy „Arlacel A"-val emulgeált „Mayolin"-t alkalmazhatunk. A fentieken kívül földimogyoróolaj- és alumíniumsztearát-alapú segédanyagokat, mint pl. a „Metábolizable Oily adjuvant No. 65" néven közismert terméket is felhasználhatunk. Adalékként továbbá kb. 2% tiszta alumíniumoxidot, vagy ezenkívül 1% alumíniumfoszfátot tartalmazó alumíniumhidroxid-oldatokat is felhasználhatunk. E két adalékot kb. 1 mg/ml oltóanyag mennyiségben adhatjuk az oltóanyaghoz. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa: Tripszinből és NIL utódsejtekből szuszpenziót állítunk elő. A szuszpenziót fixált veszettségokozó vírusok hozzáadásával megfertőzzük. Az elegyet McPherson—Stoker-táptalajt tartalmazó fermentáló lombikokba elosztjuk, és 37 C°-on inkubátorban tároljuk. Egy fermentáló lombikból kapott, 120—150 millió sejtet tartalmazó NIL-sejtszuszpenzió lehetővé teszi 2—4 liter sejtszuszpenzió előállítását, amelyet két fermentáló lombik előállítására használunk fel. A sejtek közvetlen fertőzése céljából hozzáadott vírusmennyiség olyan, hogy 1—10 fertőző dózist viszünk be sejtenként, ami egér esetén 50%-os mértékű fertőzést idéz elő. 10 15 20 25 M i'5 40 45 50 55 60 2