158691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás veszettség elleni oltóanyag előállítására

5 158691 6 Amint a sejtágy elfolyósodik, a megfertőzött sejteket tripszin segítségével eltávolítjuk az üvegből, és megfertőzetlen sejtszuszpenzióval elegyítjük. A megfertőzött/megfertőzetlen sejtszuszpenzió aránya kb. 1 : —1 : 4 térfogat. A kapott elegyet ezután a fenti táptalajjal azonos friss táptalajt tartalmazó, álló vagy forgó fermentáló lombikokba szétmérjük. A lombikokat inkubátorban 37 C°-on tároljuk. A kapott sejtszuszpenzió alikvot részét Petri-csészében mikroszkóp-tárgylemezen tenyésztjük, így a vírusfertőzés kinetikáját ellenőrizzük. Bizonyos idő — általában 48—60 óra .— elteltével különböző metszetekben megjelennek a specifikus intracitoplazmás zárványok. A kiindulási tenyésztő táptalajt ezután 10 : 1 arányban friss táptalajjal elegyítjük. A táptalaj pH-ját széndioxid bevezetésével 7-re állítjuk be. A lombikokat újabb 20—124 órán át 37 C°-os hőmérsékleten tartjuk, majd az anyagot —30 C°-on megfagyasztjuk. Az anyagot megolvasztjuk, és centrifugálással elválasztjuk a virulens folyadékot a sejtrétegtől. A virulens folyadékot ezután a sajtmaradékok eltávolítása céljából centrifugáljuk, majd csíramentes, szűrőn szűrjük. A folyadék sterilitását különböző állapotokban megvizsgáljuk. Ezen kívül még egy mintát veszünk, amelyet a fertőzöttség meghatározására és a komplementer anyag rögzítésének mérésére használunk fel. A fertőzöttség fokát egér intracerebrális beoltásával vizsgáljuk. A folyadékot ezután 1 : 4000 hígítású /?-propiolaktonnal 24 órán át 0 C°-on, majd 2 órán át 37 C°-on inaktiváljuk. Az oltóanyagot ampullákba töltjük, és laktóz stabilizátor jelenlétében fagyasztva szárítjuk. A termék bakteriológiai sterilitását és abszolút károsodásmentességét ismert kísérletekkel megvizsgáljuk, és meghatározzuk, hogy kellően legyengített, és eléggé hatékony oltóanyagot kaptunk-e. 2. példa: Diploid emberi sejtszuszpenziót (WI 38) tartalmazó lombikot HEP veszettséget okozó vírus hozzáadásával megfertőzünk. A szuszpenzió két, azonos térfogatú, Eagle tenyésztáptalajjal megtöltött lombikba osztjuk szét. Kb. 10 millió diploid-sejtet tartalmazó sejtszuszpenzió lehetővé teszi két fermentáló lombiknak megfelelő mennyiség előállítását. E sejtek egyszeri közvetlen fertőzéséhez hozzáadott vírus mennyisége 1—^10 fertőző dózis lehet sejtenként; az egerek 50%-os fertőzéséhez elegendő. A harmadik-negyedik napon a sejtekben megjelennek a veszettség kórokozójának zárványai. Az így megfertőzött diploid sejteket tripszines kezelés után szuszpenzióba visszük, és új, megfertőzetlen diploid sejtszuszpenzióval elegyítjük. Az elegyítés aránya pl. 1 térfogat megfertőzött/10 térfogat megfertőzetlen sejtszuszpenzió. A kapott elegyet 20 tenyésztő lombikba osztjuk szét. A kezdetben megfertőzött lombikok fedőfolyadékát ugyancsak 20 db, friss Eagle-táptalajjal féltöltött lombikba mérjük szét. A megfertőzött/megfertőzetlen sejtelegy, illetőleg a megfertőzött fedőfolyadék alikvot részét kivesszük, és Petri csészékben mikroszkóp-tárgylemezen tenyésztjük. A negyedik-ötödik napon immunfiuoreszcensz vizsgálat segítségével meghatározzuk a sejtekben a veszettség-kórokozók zárványait. Egy változat szerint a tenyészet táptalaját a második vagy harmadik napon új, szérumot nem tartalmazó táptalajra cseréljük. Az új, szérummentes táptalaj térfogata a kiindulási táptalaj térfogatának pl. tizedrésze lehet. A tenyésztő lombikokban levő anyagot —30 C°-on megfagyasztjuk. A virulens terméket felfogjuk, és a bakteriológiai sterilitás és a fertőzöttségi fok meghatározására mintát veszünk. A fertőzöttségi fokot újszülött egér intracerebrális beoltásával vizsgáljuk. Ezután a vírust centrifugáljuk 2400 fordulat/ perc sebességgel, sterilizált szűrőn szűrjük, és laktóz stabilizátor jelenlétében végrehajtott liofilizálás után ampullákba töltjük. Néhány lombikot ismételt bakteriológiai felülvizsgálathoz, és az élő, le nem gyengített oltóanyag szokásos hatékonysági vizsgálatához használunk fel. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás veszettség elleni oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely veszettséget okozó vírustörzset menyét-félék valamely szervéből származó sejtivadék tenyészetére vagy főemlősök diploid sejtjeinek sejttörzstenyészetére adaptálunk, a kiválasztott sejtek tenyésztését e sejteknek megfelelő és szérumot tartalmazó folyékony táptalajon végezzük, a kapott tenyészetet elkülönítjük ettől a táptalajtól és szérum nélküli, vagyis gyakorlatilag albumin nélküli közegbe helyezzük, a vírustörzset ebben a második közegben elhelyezett sejttenyészeten tenyésztjük, majd a sejtszövetek aprítása után a felülúszó folyadékot elkülönítjük és így élő csírákat tartalmazó oltóanyagot állítunk elő, vagy inaktiváljuk és így holt csírákat tartalmazó oltóanyagot állítunk elő. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vírustörzset fiatal hörcsög vese-sejttenyészetén tenyésztjük. 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 3