158344. lajstromszámú szabadalom • Eljárás W847-antibiotikumok előállítására

5 158344 6 keverés közben kb. 22 és kb. 37 C° között kb. 2—4 napon át. Általában a legelőnyösebbnek bizonyult a 35 C° hőmérséklet és 3 nap időtartam. Az ebben az első csírázási szakaszban normális körülmények között használt közeg vizes, és a mikroorganizmus által asszimilálható mennyiségű szén- és niitrogénforrást tartalmaz. A közeg pH-ját kb. 7,5-re állítjuk be autoklávozás előtt lúgnak, például nátronlúgnak a hozzáadásával. A csírázási szakaszban alkalmazott közegek például a következők: I. közeg: Bacto-Beef (marhahús) kivonat (Difoo) '3,0 g; Bacto-Tryptone (Difoo) 5,0 g; glukóz 1,0 g; burgonyakeményítő 24,0 g; Bacto-Yeast (élesztő) kivonat (Difco) 5,0 g; kalciumkarbonát 2,0 g; csapvíz 1000 ml; II. közeg: Bacto-Yeast (élesztő) kivonat (Difco) 5,0 g; halból előállított oldható anyagok 1,0 g; kukoricalekvár 1,0 g; glukóz 20,0 g; kalciumkarbonát 1,0 g; csapvíz 1000 ml. Célszerűen a fermentáció és az antibiotikum kinyerése előtt egy második csírázási szakaszt (inokulumszákasz) iktatunk be az oltóanyag dúsítására. A fent ismertetett közegeket használva friss közeg oltható be az előzőkben készült csíráztatott kultúrával (5 súly/itf%), és kb. 22—37 C°-on kb. 2—4 napig inkubálható. Rendszerint 28 C° hőmérséklet és 3 nap időtartam •a legkedvezőbb. A W847 antibiotikum-komplex termelésére az inokulumszalkaszból vett 5 súly/tf% oltóanyagot adunk a vizes fermentációs közeghez, autoklávozás előtt 7,1—7;8 pH-ra beállítva azt. A fermentációs közegbe rendszerint percenként kb. 3—6 liter levegőt vezetünk be, és a fermentációt általában kb. 22—37 C°-on végezzük kb. 2—6 napig állandó keverés közben. Különösen az alább leírt III. közeg esetében azt találtuk, hogy a W847 antibiotikum-komplex maximális hozamát 31 C°-on végzett fermentációval 66 óra alatt érjük el percenként 4,>5 liter levegő bevezetésével és percenként 250 fordulatszámú lapátos keverővel. Egy 10 liter közeget tartalmazó 14 literes fermentorban 300—800 jug/ml hozamot értünk el ilyen körülmények között. A fermentációs szakaszban használható, közegek például a következők: III. közeg: szacharóz 30,0 g; glukóz 2,5 g; triptikáz 17,0 g; nátriumnitrát 3,0 g; dikáliumthidrogénfoszfát 3,5 g; magnéziumszulf át • 7 H20 0,5 g; káliumklorid 0,5 g; vas(II)szulfát 0,01 g; nátriumklorid 5,0 g; csapvíz 1000 ml; IV. közeg: Bacto-Yeast (élesztő) kivonat (Difco) 5,0 g; glukóz 10,0 g; keményítő 20,0 g; kazemhidrolizátuni 5,0 g; kalciumkarbonát 4,0 g; csapvíz 1000 ml; V. közeg: szacharóz 20,0 g, pepton 5,0 g; gyapotmiagfehérje-hidrolizátum 5,0 g; kalciumkarbonát 4,0 g; csapvíz 1000 ml; VI. közeg: szacharóz 30,0 g; pepton 8,0 g; nátriumnitrát 3,0 g; dikáliumhidrogénfoszfát 1,0 g; magnéziumszulf át • 7 H20 0,5 g; vas(II)szulfát 0,01 g; csapvíz 1000 ml; VII. közeg: triptikáz 17,0 g; nátriumklorid 5,0 g; dikáliumhidrogénfoszfát 2,5 g; glukóz 2,5 g; Czapek—Dox-táptalaj 35,0 g; csapvíz 1000 ml. A W847 antibiotikum-komplexnek a fermentációs közegből való kinyerésére például a következőképpen járhatunk el: Az egész ferment-5 lé pH-ját lúggal, például nátronlúggal beállítjuk kb. 9,5-re. Ezután az egész fermentlevet kb. kétszeres térfogatú, alkalmas, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, mint például etilacetáttal, metiléndikloriddal, butilaoetáttal, klo-10 roformmal, butanollal és hasonlókkal extraháljuk. Az oldószeres fázist vákuumban kis térfogatra, kb. századrészére koncentráljuk, és oszlapkromatográfiai úton tisztítjuk, például kb. 95%-os vizes etanolban szuszpendált LH 20 15 Sephadexet (harántkötésű alkilezett dextrán, gyártja Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Uppsala, Svédország) alkalmazva. Az oszlopot vizes etanollal eluáljuk. A kapott frakciókat antibakteriális aktivitásuk alapján, amely kitűnik a' 20 Staphylococcus aureusszal (ATOC 6538P) végzett agarlemezes próbákból, egyesítjük, szárazra pároljuk, kevés etiléterben vagy acetonban oldjuk, és fölös térfogatú petroléterbe (fp. 30—60 C°) öntjük. Ezután a keveréket egy szárazjég-25 -aceton .hűtőkeverékbe (kb. —50 C°) állítjuk, kb. 20 percig állni hagyjuk, majd szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. Az anyalúgot dekantálással elválasztjuk az esetleges olajos maradéktól, és szárazra pároljuk. Az így kapott 30 anyag titere az alább leírt biológiai meghatározás szerint kb. 232 p.g/mg. A vizsgálatot hengeres csésze-módszerrel végezzük Sarcina lutea (ATCC 9341) alkalmazá-35 sával. A próba körülményei azonosak az eritromicinre leírt hengeres-lemezes próbáéval (Grove és Randall, 1955, Med. Encyclopedia, Inc., New York). Egy jjig W847_ antibiotikum-komplex-aktivitás az az anyagmennyiség, amely 20,8 ±0,5 40 mm-es zónás hatást vált ki ennek a próbának a körülményei között. A W847 antibiotikum-komplex előállítható továbbá a következő fermentációs és elkülönítési műveletekkel is: 45 Az oltóanyag előállítására I. közeget használunk, ezt a közeget tartalmazó fermentációs lombikokat beoltva Micromonospora sp. W847 kultúrával (kb. 5 s/tf%). A lombikokat percen-50 ként kb. 280 fordulattal járó forgó rázógópbe helyezzük, és 26 C°-on 72 óra hosszat inkubáljuk. Ezután 7,15—7,25 pH-ra beállított fermentációs közeggel (például VII. közeg) töltött fermentorokat beoltunk kb. 5 tf/tf%, 72 órás 55 oltóanyaggal. A fermentációs közeget kb. 500 percenkénti fordulattal keverjük 31 C°^on. A közegbe literenként és percenként kb. 0,5 liter levegőt vezetünk be. 24 óra elmúltával a keverést 600 percenkénti fordulatra, majd 48 óra 60 elmúltával 700 percenkénti fordulatra növeljük. A fermentációt kb. 69 óra elmúltával fejezzük be. Valamennyi fermentorból egyesítjük a fermentlevet a W847 antibiotikú'm-komplex alább leírt módon való extrahálására és kinyerésére. 65 Az egyesített fermentlé pH-ját 50%-os nát-3