158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton

158336 61 62 11. példa: 20Q—400 mesh szemcsenagyságú, klorid alakú, erősen bázisos anioncserélő műgyantából, amely a sztirol-divinilbenzol polimerrácshoz kötött kvaterner ammóniumcserélő csoportokból állott (Dowex lx'2), 84,5 cm x 1,4 cm méretű oszlopot készítettünk. A gyanta egyensúlybahozása céljából a gyantát 800 ml triszifhidroximetil)aminometán hidroklorid pufferrel (0,1 m Cl-; pH 8,0) mostuk. Ugyanennek a puffernek három ml-es részletében feloldottunk 305,5 mg nyers nátrium (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonátot, amelynek hatóanyagtartalma 19 fi/mg volt. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel hívtuk elő percenkint 1 ml sebességgel, és 5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A kilépő folyadékáramot Mecco-Matic Model 2 típusú refraktométerrel figyeltük. A bioaktivitás általánas elhelyezkedésének kiderítése céljából minden ötödik, frakció hatóanyagtartalmát megvizsgáltuk Proteus vulgaris MB—838 segítségével. Egy bioaktiv csúcsot észleltünk a 115—185. frakciókban. A 164—184. frakciókat egyesítettük és szárazra pároltuk. A maradékot vízben feloldottuk (Végső térfogat 12,0 ml volt) és az antibiotikumnak a puff értől való elválasztása végett 143 cm x 4,7 cm méretű poliákrilamid gél (Bio-Gel P—2) oszlopon perkoMl'tük. A kilépő folyadékot Mecco^etic Model 2 típusú refraktométerrel ellenőriztük. A bioaktivitás helyének megállapítása céljából a frakciók hatóanyagtartalmát Proteus vulgaris MB—-838 segítségével megvizsgáltuk. Az 1420 ml és 1680 ml közötti frakciók bioaktivitását egyesítettük, bepároltuk és fagyasztásos szárítás alá vetettük. A kapott maradék (89,6 mg) hatóanyagtartalma 46 fi/mg volt. Ezt a szennyezett antibiotikumot 5 ml vízben feloldottuk és az oldatot — a trisz(hidroximetil)aminometán csoportnak nátriummal való helyettesítése céljából — 2 ml olyan, erősen bázisos kationcserélő műgyanta oszlopon bocsátottuk át, amely nátrium alapú sztirol-divinilbenzol polimer rácsban aromás maghoz kötött szulfonsav cserélő csoportokból állott (Dowex 50). A 10 ml mennyiségű fciüépő oldatban levő (—) (cisz-il,2-epoxipropil)^foszfonsavas nátriumsó hatóanyagtartalma 480 egység/ml volt. Az oldat fagyasztásos szárítása útján 71,6 mg szárazanyaghoz jutottunk, amelynek hatóanyagtartalma 67 egység/ml volt. 12. példa: A 7. példában leírt eljárással 25%-os metanolos 2 n ammóniával kapott eluátumot fagyasztásos szárítás alá vetve 250 mg szárazanyaghoz jutottunk, amely a 7. példában leint, Proteus vulgaris-szal végzett módosított hatóanyagtartalmi vizsgálat során 0,028 mg/ml-es hígításban adott 25 mm-es inhibiciós zónát. A szárított szárazanyagot 5 ml metanolban feloldottuk, és a metanolos oldathoz 5 ml n-foutanolt adtunk. A kapott oldatot szűrtük, és a szűredéket a metanol eltávolítása céljából csökkentett nyomáson bepároltuk. Az oldhatatlan anyag eltávolítása végett a butanolos oldatot szűrtük. Az antibiotikumot tartalmazó szűredék 0,0065 mg/ml hígításban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. 10 13. példa: A 7. példában leírt eljárások szerint szennyezett (—) i(cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav timföldes kromatografálásakor 50%-os és 25'%-os metanolos 2 n ammóniával kapott, egyesített eluátumokat csökkentett nyomáson bepároltuk 500 ml térfogatra. E sűrítményhez ilÖOO mil metanolt adtunk és a kapott oldatot megszűrtük. A szűredéknek csökkentett nyomáson végzett bepárlása útján az antibiotikum vizes oldatához jutottunk, amely — a Proteus vulgaris-szal a 7. példában leírt módon végzett, módosított hatóanyagtartalom-vizsgálat során — 0,0055 mg/ml-es hígításban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 35 A fenti sűrítmény 2 ml-es részletéhez 20 ml metanolt adtunk és a kapott oldatot szűrtük. A szűredéket 60 ml n-butanollal hígítottuk, és az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítottuk. Az antibiotikumot tartalmazó szűredék 0,0025 mg/ /ml-es hígításban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. A szűredéket 8 ml térfogatra bepároltuk, és az oldhatatlan anyagot szűréssel elválasztottuk. Az antibiotikumnak így kapott, n-butanolos oldata — a módosított Proteus vulgaris-szal végzett hatóanyagtartalomvizsgálat során — 0,00,14 mg/ml hígításban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. 14. példa: A (—) (ciszr-l,'2jepoxipropil)^foszifonsav ammóniumsója vizes oldatának 20 ml-es részletéhez — amely 1020 mg szárazanyagot tartalmazott, a 7. példában leírt hatóanyagvizsgálat során 204000 egység aktivitást mutatott — 440 mg kalciumhidroxidot adtunk; a kapott oldat pH értéke 10,2 volt. Ezután az oldatot vákuumban való melegítéssel mintegy fele térfogatára bepároltuk, e ponton pH értéke 7,4 volt. E sűrítményhez kb. 10 ml vizet és 1*00 mg kalciumhidroxidot adtunk, és a kapott elegyet ismét vákuumban sűrítettük be mintegy fele térfogatára, amely 7,5 pH értéket mutatott. E sűrítményt vízzel kb. 40 ml-re hígítottuk, majd megszűrtük. A tiszta szűredéket vákuumban 15 ml térfogatra bepároltuk és a sűrítményt egy kalcium alakú, erősen savas kationcserélő műgyanta oszlopon (Dowex 50) bocsátottuk át. A műgyanta oszlopot vízzel hívtuk elő, a kapott kilépő folyadékból 10 < ml-es frakciókat gyűjtöttünk, amelyeket a Proteus vulgaris-szal végzett, módosított hatóanyagtartalom vizsgálatnak ve-31