158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton
59 158336 60 vizes nátriumklorid oldattal eluáltuk, és az eluátumból 50 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az első hat eluátumban az alábbi mennyiségű antibiotikus aktivitást találtuk: 1. 5% 2. 35% 3. 28% 4. 10% .5. 6% 6. 2%. 9. példa: A Streptomyces fradiae MA—2913 (ATCC 21099) liofilezett kultúrájával beoltottunk egy 250 ml-es terelőlapos Erlenmeyer-lombikban az alábbi összetételű steril tápoldatból egy 50 mles részletet: 10 Egy ugyanilyen eljárással végzett második fermentációban 6,75 egység/ml aktivitású lét kaptunk. A két fermentációból kapott leveket egyesítettük és szűrtük. A kapott szűrt lé szárazanyag-tartalma 20 mg/ml volt. A 7. példában leírt módosított hatóanyagvizsgálati eljárással Proteus vulgaris-szal vizsgálva, 1 : 32 hígításban adott 25 mm-es inhibiciós zónát. A lé 96,5 ml-es részletét 40 percig kevertük 2,5 g savval mosott timfölddel. A keveréket szűrtük. Az aktivitás 20%-át a szűredékben ta-15 láltuk meg. A szűrt tirnföldadszorbátumot mostuk és eluáltuk 11,2 pH értékű vizes ammónia oldattal. Az ammónia eltávolítása céljából az eluátumot bepároltuk; A módosított hatóanyagvizsgálati eljárással 0,125 mg/ml hí-20 gításban mutatott 25 mm-es inhibiciós zónát. Zabpehely Élesztő hidrolizátum MgS04 -7 H 2 0 Foszfátpuff er* Víz 10 g/liter' 10 g/liter 0,05 g/liter 2 ml az előírt térfogatig. 91 g KH2 P0 4 és 95 g Na 2 HP0 4 desztillált vízben egy literre oldva. A tápoldatot sterilezés előtt 6,5 pH értékre állítottuk be. A beoltott lombikot 28 C°-on 24 óra hosszat inkubáltuk körrázóberendezésben. A kapott tápoldat 10 ml-es részletével ugyanannak a steril tápoldatnák egy másik 50 ml-es részletét beoltottuk egy második Erlenmeyer-lombikban. 24 óra hosszat 28 C°-on inkubáltuk körrázóberendezésben, azután a kapott fermentációs lével beoltottunk 3 liter alábbi összetételű steril tápoldatot egy ötliteres fermentálótartályban : Zabpehely Szeszgyári cefre Szójaliszt Nátriumcitrát Nátriumaszkorbát Víz 30 g/liter 10 g/liter. 25- g/liter 4 g/liter 0,5 g/liter az előírt térfogatig. A tápoldat pH értékét sterilezés előtt 6,5-re állítottuk be. A beoltott tápoldatot azután 28 C°-on 4 napig inkubáltuk rázás közben. Levegőztetés céljából a tápoldaton percenkint 3 liter levegőt vezettünk át. A túlzott habzás meggátlására 3 ml kb. 2000 molekulasúlyú propilénglikol polimert adagoltunk az oldathoz (a Dow Chemical Company Poliglikol P—2000 kereskedelmi néven hozza forgalomba). Az így kapott fermentációs lé aktivitása a Proteus vulgaris segítségével végzett standard hatóanyagvizsgálati módszerrel meghatározva 5,9 egység/ml volt. 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10. példa: 50—ilOO mesh szemcsenagyságú, klorid alakú, erősen bázisos anioncserélő műgyantából, amely sztirol-divinilbenzol polimerrácshoz kötött kvaterner ammóniumcserélő csoportokból állott (Dowex 1x2), 84,5 cm x 1,4 cm méretű oszlopot készítettünk. A műgyantát 725 ml 0,1 n nátriumklorid oldattal mostuk, hogy a műgyantát egyensúlyba hozzuk. Egy ml 0,1 m nátriumklorid oldatban feloldottunk 36 mg-ot a 6. példában leírt módon készített nyers nátrium (—) (cisz^l,2-epoxipropil)^foszfonátból, amely 27 /i/mg hatóanyagot tartalmazott, és az oldatot felöntöttük a gyantaágy tetejére. Ezután az oszlopot 0,1 m nátriumkloriddal előlhívtuk percenkint egy ml adagolással, és öt ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A kilépő oldatot Mecco-Matic Model 2 típusú refraktométerrel ellenőriztük. A bio aktivitás általános elhelyezkedésének kiderítése céljából minden ötödik frakciót megvizsgáltunk hatóanyagtartalomra a Proteus vulgaris MB—838 segítségével. Két bioaktiv csúcsot figyeltünk meg: az A—1 frakciónak elnevezett 180—i268. frakciókat és az A—2 frakciónak elnevezett 420—560. frakciókat. Mind a két csúcs esetében egyesítettük a fent megnevezett frakciókat és bepároltuk őket egyenkint 10 ml térfogatra. Az antibiotikumnak a nátriumkloridtól való elválasztása végett mindegyik sűrítményt per. koláltuk egy poliakrilamid gél oszlopon (Bio-Gel P-2) (ISO cm x 1,5 cm). A kilépő oldatot Mecco—Matic Model 2 típusú refraktométerrel figyeltük. A bioaktivitás helyének rögzítése céljából elvégeztük a frakciók hatóanyagvizsgálatát Proteus vulgaris MB—838 segítségével. A 114 és 250 ml között mutatkozó bio aktivitást egyesítettük, besűrítettük és fagyasztásos szárítás, alá vetettük. Az 1,4 mg mennyiségű A—1 frakció hatóanyagtartalma 277 /A/ml, a 3,5 mg mennyiségű A—2 frakcióé pedig 170 /i/mg volt. 30
