158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton
158336 57 58 eluálásra. A 75%-os metanolos 2 n ammóniával kapott eluátumot négy egyliteres frakcióban gyűjtöttük be és megvizsgáltuk hatóanyagtartalomra. A vizsgálati eredmények szerint csak jelentéktelen mennyiségű aktivitásuk volt, ezért elöntöttük őket. Az 50%-os metanolos 2 n ammóniával kapott eluátumokat ugyancsak négy egyliteres frakcióban gyűjtöttük be. Ezek szárazanyag-tartalma és hatóanyag-tartalma a következő volt: Frakció összes szárazanyag 1 15 2 31 3 16 4 5 0,75 0,24 0,13 0,O6 Frakció Összes Hatóanyagvizsgálat szárazanyag-tartalom mg/ml 26 mm-es g gátlási övezetre 4,99 8,1 4,4 2,0 0,10 0,04 0,03 0,04 A vizes 2 n ammóniával kapott eluátumot négy egyliteres frakcióban gyűjtöttük be. Az 1. frakció összes szárazanyag-tartalma 2,9 volt, és 0,12 mg/ml koncentrációban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát, a 2. frakcióban 4,0 g volt az összes szárazanyag-rtartalom, és 0,16 mg/ml koncentrációban adott 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát. A többi két frakcióban csak jelentéktelen mennyiségű antibiotikum volt jelen, ezért ezeket elöntöttük. A fenti eluátumfrakciók mindegyikét liofileztük. A legutolsó három frakció eluálása útján (50%-os metanolos 2 n ammóniával) kapott szárazanyagot egyesítettük, háromszor feliszapoltük 500 ml metanollal, azután szűrtük. A metanolos kivonatokat egyesítettük és csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra sűrítettük be. Az így kapott sűrítmény szárazanyagtartalma 7,5 g volt, és 0,006 mg/ml koncentrációban adott 25 mm átmérőjű gátlási zónát. E sűrítmény 134 ml-es részletét 100 g savval mosott timföldoszlopon kromatografáltuk. Állandó (exponenciális) gradienst használtunk. Két liter 75%-os metanolos 2 n ammóniával kezdtük, percenkint 1 ml-es sebességgel, és állandóan fenntartottuk az eluáló oldat kétliteres térfogatát 2 n vizes ammónia adagolásával. A képződő eluátumot 20 ml-es frakcióba gyűjtöt-10 Hatóanyagvizsgálat mg/ml 25 mm-es gátlási zónára ,, 20 A 25%-os metanolos 2 n ammóniával kapott eluátumot négy egyliteres frakcióba gyűjtöttük be. E frakciók szárazanyag-tartalma és hatóanyagtartalma a következő volt: 25 ?,0 35 40 50 55 60 65 tük be. A legnagyobb aktivitást mutató 10—25. frakciót egyesítettük és csökkentett nyomáson 1 ml térfogatra sűrítettük. A sűrítményt azután 12 ml metanolban oldottuk- és azonos térfogatú n-butanollal elegyítettük. A metanolt csökkentett nyomáson lepároltuk. A butanolban oldhatatlan anyagot eltávolítottuk. Az antibiotikum butanolos oldatának az ebben a példában leírt módosított eljárással való hatóanyagvizsgálata szerint 0,005 mg/ml koncentrációban adott 25 mm-es inhibiciós zónát. 8. példa: A Streptomyces fradiae MA—2913 (ATCC 21099) liofilezett kultúrájával beoltottunk 50 ml alábbi összetételű steril tápoldatot egy 250 mles terelőlapos Erlenmeyerlombikban: Zabpehely Élesztő hidrolizátum Foszfátpuífer* MgS04 -7 H 2 0 Desztillált víz 10 g/liter 10 g/liter 2 ml 0,05 g/liter az előírt térfogatig 91 g KH2 P0 4 és 95,0 g Na 2 HP0 4 desztillált vízben egy literre oldva. A beoltott lombikot azután 28 C°-on 24 óra hoszat inkubáltuk körrázógépen. A kapott fermentációs lének 10 ml-es részletével beoltottuk egy másik 250 ml-es terelőlapos Erlenmeyerlombikban ugyanannak a steril tápoldatnak további 50 ml-es részletét. A kapott beoltott tápoldatot 28 C°-on 24 óra hosszat inkubáltuk körrázóberendezésben. A kapott fermentációs lével beoltottuk az alábbi összetételű steril tápoldat 2600 ml-es részletét egy ötliteres fermentálótartályban: Zabpehely Kukoriealekvár 45 Szójaliszt Víz 30 g/liter 10 g/liter 10 g/liter az előírt térfogatig. Az oldat pH értékét sterilezés előtt 6,6-ra állítottuk be. A beoltott tápoldatot ezután 28 C°-on 4 napig inkubáltuk rázás közben, percenkint 3 liter levegőt vezetve át a fermentációs lén. A kapott fermentációs levet. megszűrtük, ennek a 2350 ml lének pH értéke 9,0, aktivitása pedig a Proteus vulgaris-szal végzett korongos eljárással meghatározva 3,8 egység/ml volt. A fermentációs lé 750 ml-es részletét olyan oszlopon bocsátottuk át, amely 50 ml-t tartalmazott egy klorid alakú, kvaterner ammónium típusú, erősen bázisos anioncserélő műgyantából (Dowex 1 x 2). Az oszlopból kilépő elhasznált lében csupán csekély mennyiségű antibiotikum volt. A kapott műgyanta adszorbátumot 1%-os 29
