158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton
158336 49 50 A desztillált vízzel végzett eluálás alatt az oszlopot differenciál regisztráló refraktométerrel figyeltük. A 21—24. frakcióban 1,88 Kav értékű só jelenlétét észleltük. Az antibiotikus aktivitást mutató frakciók Kav értéke 1,56 volt. 6. példa: A Streptomyces fradiae MA—2898 (ATCC 21096) liofilezett kultúrájával beoltottuk az alábbi összetételű steril tápoldat 50 ml-es részletét: Élesztőkivonat Glükóz MgS04 -7 H-fO Foszfátpuffer* Desztillált víz 10 g/liter 10 gTliter 0,5 g/liter 2 ml az előírt térfogatig 91 g KH2 P0 4 és 95 g Na 2 HP0 4 desztillált vízben egy literre oldva. A beoltott lombikot ezután percenkint 220 fordulatszámú, 5 cm löketű, körrázóberendezésre helyeztük és 48 óra hosszat 28 C°-on inkubáltuk. A képződő vegetatív kultúra 10 ml-es részletével beoltottunk egy kétliteres terelőlapos Erlenmeyer lombikot, amely az előbb megadott összetételű steril tápoldat 500 ml-es részletét tartalmazta, azután a beoltott lombikot egy percenkint 220 fordulatszámú körrázógépre helyeztük és 48 óra hosszat 28 C°-on inkubáltuk. Az így kapott fermentációs tápoldattal beoltottunk egy 189 l-es rozsdamentes acél fermentálótartályt, amelybe 160 liter fenti összetételű steril tápoldatot töltöttünk. A beoltott tápoldatot 28 C°-on rázás közben inkubáltuk, miközben percenkint k'b. 90 1 levegőt vezettünk a fermentált tápoldaton keresztül. A fenmentációs időszak alatt csekély mennyiségű Poliglikol 2000 készítményt adagoltunk a habzás csökkentése céljából. A kapott fermentációs tápoldat 25 literes részletét oltóanyagként használtuk fel egy 760 l-es rozsdamentes acél fermentálótartály beoltására, amely az alábbi összetételű steril tápoldat 510 literes részletét tartalmazta: Zabpehely Szeszgyári cefre Szójababliszt Nátriumacetát Nátriumaszkorbát Deseztillált víz 10 15 20 25 30 35 40 45 50 glikol 2000 nevű habzásgátlószerből csekély mennyiséget adagoltunk a fermentációs tápoldat túlságosan erős habzásának meggátlására. Ezután kovaföld segítségével megszűrtük a fermentációs tápoldatot. A szűrt tápoldat pH értéke 7,9 volt, összes szárazanyagtartalma 13,4 mg/ml-t tett ki. A Proteus vulgaris-szal végzett korongos lemezes hatóanyagtartalmi vizsgálat során a szűrt tápoldat ml-enkint 0,8 egység (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-ifoszfonsavat tartalmazott, a tápoldat szárazanyagtartalmának 0,06 egység/ml-nyi aktivitással szemben. A szűrt tápoldat 378 l-es adagját 7 pH-ra állítottuk be, majd átbocsátottuk egy erősen bázisos anioncserélő műgyantaoszlopon, amely sztiroljdivinilbenzol matrixre épült kvaterner ammónium típusú (Dowex 1x2) volt. A kapott műgyanta adszorbátumot 90%-os metanollal készült 3%-os ammóniumklorid oldattal eluáltuk és az eluátumot 8 l-es frakciókként gyűjtöttük. A 4., 5. és 6. frakció, amely a legtöbb antibiotikumot tartalmazta, a következő elemzési adatokat mutatta: 20 g/liter 10 g/liter 20 g/liter 2 g/liter 0,5 g/liter az előírt térfogatig E tápoldat pH értékét sterilizálás előtt 6,5-re állítottuk be, azután a beoltott tápoldatot 28 C°-on inkubáltuk rázás közben három napig. Közben percenkint 300 1 levegőt vezettünk át az oldaton. A fermentációs időszak alatt a Poü-55 60 65 •8 2 M £ S-l N Összes szárazanyag Hatóanyag 4 15,1 mg/ml 5 21,7 mg/ml 6 36,2 mg/ml 14 egys./ml 14 egys./ml 4 egys./ml Hatékonyság 0,93 egys/ml 0,65 egys./ml 0,11 egys./ml A 4. és 5. frakciót csökkentett nyomáson külön-külön pároltuk be a metanol, eltávolítása céljából, kb. 200 mg/ml összes szárazanyagltartalomnak megfelelő ikoncentrációra. Az 5. frakció sűrítményének 275 ml-es részletét, amely kib. 51 g összes szárazanyagot tartalmazott, 8,9 liter gömb alakú, 50—100 mesh szemcsenagyságú poliakirilamid gélen bocsátottunk át, ami lehetővé tette a 200 és 2000 molekulasúly közötti anyagok íriakoionáMsélt, sőtalanítását és besűrítését (ez a gél Bio-gel P-—2 néven kereskedelmileg kapható a Bio-Rad Laboratories oégnél, Richmond, California). A kapott góladszorbeátumot percenkinit 50 •ml sebességű vízzel előhívtuk, miközlben <az elíuátuimot refraktométerrel figyeltük. Az eluátumot frakciónkinlt gyűjtöttük, megvizsgáltuk, és a megfelelő aktív frakciókat egyesítettük. Az 5600 ml és 6230 ml közötti 635 ml-^nyi eiuátum 19,1 mg/ml összes szárazanyagot .tartalmazott, és aktivitása a fentebb leírt Proteus vulgáris-szal végzett korongos módszerrel mérve 68,4 egység volt ml-enkint. Ez annyit jelenít, hogy a (—) (cisz-l,2^epoxip!ropil)-foszifonsav hatékonysága 3,6 egység/ml. Azonos módon még négy. további kromatogramot vettünk fel, éspedig az 5. frakció konoentrátuimából egy 275 ml-es és egy 287 ml-es részPieitet, a 4. frakció koncentrátumából pedig két, egyenkint 285 ml-es részletet. Az öt kro-25.
