158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton

158336 47 48 A beoltott lombikot azután egy percenkint 220 fordulatszámú körrázógépre helyeztük, amely 5 cm-es lökettel dolgozott, és 48 óra hosszat 28 C°-on inkubáltuk. Az így kapott fermentációs tápoldattal beoltottunk egy második fázisú inokulumot, amely egy 250 ml-es rekeszes Erlenmeyer lombikból állott, amelyben 50 ml volt ugyanebből a tápoldatból. Az oltáshoz 2% oltóanyagot használtunk. E második fázisú inokulumot ugyancsak körforgó rázógépen rázattuk két napog 28 C°-on. E vegetatív kultúra 10,5 ml-es részletével beoltottunk egy kétliteres rekeszes Erlenmeyerlombikot, amely az alábbi (alkotórészekből készült, sterilizett tápoldat 350 ml-es részletét tartalmazta : Száraz zabliszt-Paradicsompüré Desztillált víz 20 g/liter 20 g/liter az előírt térfogatig A kétliteres lombikokat egy, percenkint 145 fordulatszámú, 5 cm löketű rázógépen 72 óra hosszat 28 C°-on inkubáltuk. Az inkubációs időszak végén tíz ilyen lombik tartalmát egyesítettük és a micéliumokat kovaföldön át végzett szűréssel eltávolítottuk. Az így kapott szűrt fermentációs táppldat a fent leírt eljárás szerint Proteus vulgaris MB—838-cal végzett hatóanyagvizsgálat során 29 mm átmérőjű irihibiciós övezetet adott. 10 15 20 25 30 5. 35 mm átmérőjű zóna 6. 22 mm átmérőjű zóna 7. 17 mm átmérőjű zóna 8—10. Nincs aktivitás. A 4. frakciót, amely a legtöbb antibiotikumot tartalmazta, vákuumban besűrítettük a metanol eltávolítása céljából, azután vízzel 50 ml-re hígítottuk. .A 833A antibiotikum így kapott vizes oldatának pH értéke 5,6, összes szárazanyagtartalma 37 mg/ml volt. A Proteus vulgaris-szal a fenti módon végzett hatóanyagvizsgálat során 1 : 100-as hígításban 25,5 mm átmérőjű zónát mutatott. A 833A antibiotikumnak ez az oldata papírcsík-kromatográfiás vizsgálat során, az 1. példában leírt eljárások után az alábbi Rf értékeket mutatta: Bioautográfiás . mikroorganizmus Proteus vulgaris MB—838 Erwina atroseptica MB—1159 Rf érték a „K" „C" oldórendszerben 0,32 0,35 0,78 0,72 Ugyanennek a terméknek az 1. példában leírt módon végzett papírcsík-elektroforézise az alábbi eredményeket adta: 4. példa: A 2. példában leírt módon készített, szűrt fermentációs tápoldat 2,6 liternyi részletét egyesítettük a 3. példában leírt módon készített, szűrt fermentációs tápoldat 3 liternyi részletével. Az elegy a Proteus vulgaris MB—838-cal a fent leírt módon végzett hatóanyagvizsgálat során 26 mm átmérőjű inhibiciós övezetet adott. Az 5,6 liternyi fermentációs tápoldatot 7,0 pH értékre állítottuk be és átengedtük 100 ml erősen bázikus anioneseirélő műgyantát tartalmazó oszlopon, percenkint 10 ml-es sebességgel. A műgyanta sztirol-divinilbenzol polimerrácshoz kötött kvaterner ammóniumcserélő csoportokat tartalmazott (Dowex 1 x 2) klorid alakban. A kapott elhasznált tápoldat a Proteus vulgarisszal a fenti módon végzett hatóanyagvizsgálat során nem mutatott antibiotikus aktivitást. A kapott Hiűgyanta-adszorbeátumot kb. 100 ml vízzel mostuk, majd ammóniumkloridnak 90%-os metanollal készült 3%rOS oldatával eluáltuk. Az eluátumot 50 ml-es frakciókban fogtuk fel, amelyek a fent leírt, Proteus vulgarisszal végzett standard hatóanyagvizsgálat során az alábbi aktivitás-értékeket mutatták: 35 Bioautográfiás mikroorganizmus Proteus vulgaris MB—838 Erwina atroseptica MB—1159 40 45 50 55 60 Mozgás az anód felé, cm 11,8 10,1 1. Nincs aktivitása 2. 26 mm átmérőjű zóna 3. 28 mm átmérőjű zóna 1 : 25 hígításban 4. 26 mm átmérőjű zóna 1 : 100 hígításban fi5 5. példa: A 4. példában leírt módon készült műgyanta eluátum 3. és 5. frakcióját egyesítettük és vákuumban 50 ml-re sűrítettük. pH értéke 5,4, összes szárazanyag-tartalma 72 mg/ml volt. Proteus vulgaris-szal végzett hatóanyagvizsgálat során ez a sűrítmény, vízzel 1 : 40 arányban végzett hígítás után, 27 mm átmérőjű övezetet mutatott. A (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav e vizes oldatának 5 ml-es részletét 200—2000 molekulasúlylhatárok között használható 100—200' mesh szemnagyságú gömb alakú poliakrilamid gél (Bio-gel P—-2) 35 grammos adagjával készült oszlopon kromatografáltuk. A gél-adszorbátumot desztillált vízzel előhívtuk, óránkint 25 ml-es sebességgel, és 4—6 ml-es eluátumfrakciókat gyűjtöttünk. A 17—i21. frakciók a Proteus vulgaris-szal végzett korongos hatóanyagvizsgálat során antibiotikus aktivitást mutatták. Tisztaságuk kb. 3—5-ször nagyobbnak bizonyult, mint a kiindulási anyag tisztasága. 24