158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton
45 158336 46 fúziós lemepróbában 11 mm-es inhibiciós zónát létesített. A folyadékban levő (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav mennyiségét agar-diífuziós próbákkal oly módon állapítottuk meg, hogy 7 mm átmérőjű szűrőpapírkorongokat mártottunk a folyadékba és ezeket helyeztük a vizsgálati lemezek felületére. Utóbbiak 5 ml agart (Difco) és 0,2% élesztőkivonatot (Difco) tartalmaztak, amelyet baktériumos oltóanyaggal oltottunk be. Az inhibiciós zónák átmérőjét egy éjen át 25 C°-on történt inkubálás után milliméterekben állapítottuk meg. A négynapos inkubálás után a folyadékokkal végzett hatóanyagvizsgálatoknál 11 mm átmérőjű inhibiciós övezetet találtunk a Proteus vulgaris MN-838 kultúrával beoltott lemezen és 25 mm átmérőjűt az Erwina atroseptica MLN-1159 kultúrával beoltott lemezen. A papírcsík-kroimatográfiás mozgékonyságot úgy határoztuk meg, hogy a Whatman 3. sz. szűrőpapírból készült csíkokat a kezdővonalon lecsöpögtettük négynapos inkubálás után kapott tápoldattal, majd a „K" jelű (70fl/o izopropanolból és 30% 6,0 pH-értékű 0,01 m foszfátpufferből álló) oldószerrel vagy a ,,C" jelű (2% nátriumklorid oldat 75%-os vizes metanolban) oldószerrel előhívtuk. Az eredményeket bioautográfiás úton tettük láthatóvá, 0,2%-os élesztőkivonatot tartalmazó, vékony tápoldatos agar lemez segítségével, amelyet baktériumos oltóanyaggal oltottunk be. Az éjen át történt inkubálás után észlelt mozgékonysági értékek az inhibiciós övezet közepének Rf értékeiben kifejezve a következők voltak: Bioautográfiás mikroorganizmus Proteus vulgaris MB—383 Erwina atroseptica MB—,1159 Rf érték a K" C" jelű oldószerben 0,36 0,28 0,73 0,7! 10 15 20 25 35 40 AO tápoldat összetétele: Marhahúskivonat Kazeinhidrolizátum Dextróz Nátriumklorid Desztillált víz 3 g/liter •10,6 g/liter 10 g/liter 5 g/liter a megadott térfogatig a Streptomyces fradiae MA—3898 (ATCC 21096) ferde-agaros kultúráját adtuk hozzá, amelyet az alábbi összetételű FA agáron kaptunk: Agar Élesztőkivonat Glükóz MgS04 -7 H 2 0 Foszfátpuff er* Desztillált víz 20 g/liter 10 g/liter 10 g/liter 0,05 g/liter 2 ml az előírt térfogatig 91 g KH2 P0 4 és 95 g Na 2 HP0 4 desztillált vízben egy literre oldva. Egy 50 ml steril AO tápoldatot tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot beoltottunk 3 ml fenti sejtszuszpenzióval. Ezután a lombikokat 72 óra hosszat 28 C°-on rázattuk egy percenkint 220 fordulatszámú körrázógépen 5 cmes lökettel. A kapott oltóanyaggal beoltottunk egy kétliteres terelőlapos Erlenmeyer lombikokból álló sorozatot. Egy-egy lombikban levő 350 steril FD tápoldathoz 10,5 ml vegetatív kultúrát adagoltunk. Ezután a beoltott lombikokat 96' óra hosszat inkubáltuk egy percenkint 145 fordulatszámú rázógépen, 5 cm-es lökettel, majd a tíz lombik tartalmát egyesítettük. Az így kapott, 6,6 pH értékű fermentációs tápoldatot kovaföldön megszűrtük. A szűrt tápoldat Proteus vulgaris kultúrával végzett hatóanyagvizsgálatunk során, amelyet a fent leírt módon hajtunk végre, 26 mm-es inhibiciós zónát mutatott. Az antibiotikum mozgékonyságát ugyanabban -45 a tápoldatban úgy határoztuk meg, hogy az antibiotikum oldatával lecsöppentett papírcsíkokat 0,165 m, 7,0 pH. értékű foszfátpuff érrel megnedvesítettük és egy hűfött egységben 600 Volt mellett 2,5 óra hosszat előhívtuk. Az ered- 50 3. példa: menyeket úgy tettük láthatóvá, hogy 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó híg tápoldatos agáron bioautográfiásan vizsgáltunk, és megállapítottuk, hogy a kezdőponttól az inhibiciós övezet közepéig hány- centimétert haladt az 55 aktív anyag. Ilyen körülmények között az antibiotikum az Erwina atroseptica-val beoltott bioautográfiás lemezen 11,5 cm-es előrehaladást mutatott. Az FD tápoldatot úgy készítettük, hogy 20,0 g száraz zablisztet és 20,0 g paradicsompürét forró desztillált vízzel 1 literre hígítottuk. Liofilezett Streptomyces MA—2898 (ATCC 21096) kultúrával beoltottuk az alábbi alkotórészekből készült steril FA tápoldat 50 ml-es részletét: 60 2. példa: Az alábbi összetételű steril AO tápoldat 10 ml-es részletéhez, amely sterilizálás előtt 7,2 pH értékű volt. 65 Élesztőkivonat Glükóz MgS04 -7 H 2 0 Foszfátpuffer* Desztillált víz * 91 10 g/liter 10 g/liter 0,05 g/liter 2 ml az előírt térfogatig 91 g KH2 P0 4 és 95 g Na 2 HP0 4 desztillált vízben egy literre oldva. 23
