158163. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezocisztreptamin származékok és savas addiciós sóik előállítására
15 158163 16 Pepton (kazeinből pankreászos lebontással käpott) 15 g Szójaliszt (papainnal lebontott) 5 g Nátriumklorid 5g Agar 15 g Desztillált víz 1 liter A táptalajokat 28 C° hőmérsékleten 1 napon át inkubáljuk és a ferde tenyészetekről származó telepeket egyenként felszuszpendáljuk 10 ml 0,1%-os steril nátriumheptadecilszulfát-oldatban. II. lépés: tenyésztáptalajt készítünk, melynek összetétele (súly/térfogat) az alábbi. Szójababliszt, 44% protein 1,0 % (oldószerrel extrahált) Állati pepton 1,75% Ammóniumklorid 0,4 % Vízzel kiegészítve 100%-ra A táptalaj pH-ját 10 n natriumhidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk be, majd hozzáadunk 0,5 súly/ térfogat% kalciumkarbonátot. Ebből a táptalajból 12 liternyit beadagolunk egy 30 literes fermentorba. A táptalajt 90 percig 121 C°-ra hevítve sterilizáljuk, majd hagyjuk lehűlni és beoltjuk a Bacillus cireulans NRRL B— 3313 40 ml nátriumheptadecilszulfátos spóraszuszpenziójával, melyet az I. lépésben leírt módon készítettünk. A beoltott táptalajt 26—27 C° hőmérsékleten 32 órán át inkubáljuk, eközben 200 ford./perc sebességgel keverjük és 6 liter/ perc mennyiségben steril levegővel levegőztetjük. Ezalatt az idő alatt részletekben mintegy 36 g lardolajból, ásványolajból, mono- és diglioeridekből álló keveréket adunk hozzá az erős habzás meggátlására. III. lépés: 113,5 liter táptalajt, melynek összetétele azonos azzal, amelyet a II. lépésben használtunk, beadagolunk egy 189 literes fermentorba. A táptalajt 121 C°-on 60 percig sterilizáljuk, lehűtjük és beoltjuk 400 ml növekedésben levő 32 órás tenyészettel, amely a II. lépésből származik. A fermentációt 32 órán át 25—27 C° hőmérsékleten folytatjuk le 269 liter/perc levegőztetés közben és habzásgátló szernek szükség esetén történő hozzáadásával. IV. lépés: táptalajt készítünk, melynek összetételét a II. lépésben már leírtuk, de amely még 4,0(súly/térfogat) % glicerint is tartalmaz. Ebből a táptalajból 568 litert beadagolunk külön-külön 2 darab, egyenként 757 liter térfogatú fermentorba, a táptalajt hővel sterilizáljuk és. lehűtjük. Az egyes fermentorokat beoltjuk 56,8 liter, a III. lépésből származó növekedésben levő 32 órás tenyészettel és 122 órán keresztül 29,5—• 30,5 C° hőmérsékleten inkubáljuk, keverés és 481,5 liter/pére levegőztetés közben. Az egyes fermentorokhoz körülbelül 15 liter habzásgátló szert adagolunk részletekben, a szükségletnek megfelelően. A termék elkülönítése és tisztítása: a IV. lépésből származó fermentleveket egyesítjük és a kombinált fermentációs folyadékot, melynek térfogata 1154,5 liter, pH-ja 6,8, 1 órán keresztül 5 48 liter ammónium formában levő karbox.il gyantával keverjük. Gyantaként például Amberlite IRC-—50-et használhatunk. A gyantát az. adszorbeált anyaggal együtt leülepítjük és vízzel addig mossuk, amíg szuszpendált szilárd anya-10 goktól mentessé válik. A mosott gyantát betöltjük egy 15,24 cm átmérőjű üvegből készült oszlopba, amely alsó rétegként már 10,5 liter friss karboxil-gyantát tartalmaz ammónium-formában. Az így megtöltött oszlopot 3710 liter 0,1 mó-15 los ammóniumhidroxid-oldattal mossuk a szenynyezések eltávolítása céljából, majd az ambutirozin terméket 378,5 liter 1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal végzett eluálással eltávolítjuk. Az 1 mólos ammóniumhidroxidos eluátumot 22 li-20 ter térfogatra betöményítjük, a pH-ját híg kénsavval 7-re beállítjuk és 0,0-3 ml/ml gyanta/ perc sebességgel átvezetjük egy oszlopon, amely az előbbi gyantából 275 ml-t tartalmaz ammónium formában. Ebből az oszlopból a gyantát az 25 adszorbeált anyaggal együtt eltávolítjuk és egy 5,08 cm átmérőjű üvegoszlopban levő 825 ml friss gyanta fölé helyezzük. Az oszlopot 49 liter 0,1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal mossuk a szennyezések eltávolítása céljából, majd az am-30 butirozin terméket 4 liter 1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. Az ambutirozint tartalmazó eluátumot vákuumban kis térfogatra betöményítjük, szűrjük és liofilizáljuk. így maradékként ambutirozint kapunk, melynek fajlagos „5 forgatóképessége [a]o 25 = +26° (1,1%, vízben). A termék mikroanalízis alapján 45,41% szenet, 7,26 % hidrogént és 12,83% nitrogént tartalmaz. A sósavas és kénsavas sót úgy állítjuk elő, .. hogy a szabad bázis vizes oldatához feleslegben sósavat vagy kénsavat adunk. A só aceton hozzáadására kiválik. Az említett eljárással kapott szulfát fajlagos forgatóképessége [a]o25 = 29° (2%, vízben). Mikroanalízis alapján 32,32% szenet, 6,20% hidrogént és 8,64% nitrogént tartalmaz. Vízbén a pK'a értékek: 6,5, 8,1 és 9,5. A jelen példa szerinti eljárásban a Bacillus cireulans NRRL B—3313 törzset helyettesíthetjük a Bacillus cireulans NRRL B—3312 jelű törzs tenyészetével, ugyanazzal az eredmény-50 nyel. 2. példa 55 I. lépés: a Bacillus cireulans NRRL B-3313-ból spóraszuszpenziót készítünk 0,1%-os steril nátriumheptadecilszulfát-oldatban, az 1. példa I. lépésében ismertetett módon. |SA II. lépés: a fermentációt ugyanúgy végezzük, ahogyan azt az 1. példa II. lépésében leírtuk, kivéve, hogy a 12 liter táptalajt csak 10 ml Bacillus cireulans NRRL B—3313 nétriumheptade-65 cilszulfátos szuszpenzióval oltjuk be. 8
