158163. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezocisztreptamin származékok és savas addiciós sóik előállítására
17 158163 18 III. lépés: tenyésztáptalajt készítünk, melynek összetételét az 1, példa II. lépésében már leírtuk. A táptalaj pH-ját 10 n nátriumhidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk be, majd hozzáadunk 0,5 súly/ térfoga t°/o kalciumkarbonátot és 0,1 súly/térfogat0/!) polipropiléngliköl habzásgátlószert. Polipropilénglikolként például Polyglycol P2000-et használhatunk. 2 db 189 literes f ermentorba' a fenti elegyből beadagolunk 113,5 litert, az elegyet 121 C°-on 60 percig sterilizáljuk, lehűtjük és beoltjuk 200 ml növekedésben levő 32 órás tenyészettel, amely a II. lépésből származik. A fermentációs elegyeket 32 órán át 29—31 C°-on inkubáljük 269 liter/perc levegőztetés mellett. IV. lépés: táptalajt készítünk, melynek összetétele a III. lépésben leírttal azonos, de az még 4,0 súly/térfogat% glicerint is tartalmaz. Ehhez polipropiléngliköl habzásgátlót adunk. 4 darab 757 literes fermentor mindegyikébe beadagolunk a fenti elegyből 568 litert, hővel sterilizáljuk, lehűtjük és. beoltjuk 56,8 liter III. lépésből származó 32 órás növekedésben levő tenyészettel. Valamennyi fermentációs elegyet 128 órán át 29—31 C° hőmérsékleten inkubáljük 481,5— 963 liter/perc levegőztetés közben. Szükséges esetben részletekben polipropiléngliköl habzásgátlószert adunk hozzá. A termék elkülönítése és tisztítása: a négy fermentorból származó fermentációs folyadékot egyesítjük és a kombinált fermentlevet (2309 liter; pH 6,9) egy órán át 127 liter ammónium formában levő karboxil-gyantával keverjük. A gyantát az adszorbeált anyaggal együtt leülepítjük és a szuszpendált szilárd szennyeződéseket a gyantánlak vízzel történő mosásával eltávolítjuk. A mosott gyantát ezután betol tjük egy 30,48 cm' átmérőjű oszlopba, amely alsó rétegként már 113 liter ammónium formában levő friss karboxil-gyantát tartalmaz. Az így megtöltött oszlopot 16 466,5 liter 0,1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal mossuk a szennyezések eltávolítása céljából, majd az ambutirozin terméket kinyerjük oly módon, hogy az oszlopot 1892,7 liter 1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. Ezt az eluátumot vákuumban 179,8 liter térfogatra betöményítjük, pH-ját híg kénsavval 7-re beállítjuk, majd 0,03 ml/ml gyanta/perc sebességgel átvezetjük egy oszlopon, amely 3,5 liter ammónium formában levő karboxil-gyantát tartalmaz. A gyantát 2 liter vízzel mossuk, majd elhelyezzük egy 10,16 cm átmérőjű üvegből készült oszlop tetejére, amely 10,5 liter friss gyantát tartalmaz. Az oszlopot 1033,5 liter 0,1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal mossuk a szennyezések eltávolítása céljából, majd 3 egyenlő részletben összesen 170,3 liter 1 mólos ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk: Az első 56,8 literes frakció tartalmazza főleg az ambutirozin terméket; ezt vákuumban 4 liter térfogatra betöményítjük, a pH-ját híg kénsavval 6,2 értékre beállítjuk és 1 óra hosszat keverjük 813 g vízzel mosott aktív szénnel és 400 g savval mosott diatoma-földdel. Például Darco G—60-at és Celite 545-öt használhatunk. A keveréket szűpjük és a szűrőlepényt 80 liter vízzel mossuk. A szűredéket és a mosóvizet egyesítjük, vákuumban 4 liter térfogatra betöményítjük, szűrjük és liofilizáljuk. A termék az ambutirozin szulfát-sója, mely-5 nek fajlagos forgatóképessége [O]D25 =+ 29° (2%, vízben). Mikroanalízis alapján^ 31,85% szenet, . 6,28,0 / 0 hidrogént, 8,83% nitrogént, 8,01% ként és 24,01% szulfátot tartalmaz. A pK'a értékek vízben 6,5, 8,1 és 9,5. 10 3. példa I. lépés: steril 0,il%-os nátriumheptadecilszulfát oldatban a Bacillus circulans NRRL B—3313 15 spóraszuszpenzióját készítjük el, ahogy azt az 1. példa I. lépésében már leírtuk. II. lépés: tenyésztáptalajt készítünk, melynek összetétele (súly/térfogat) az alábbiakban meg-20 adott. Szójababliszt, 44% protein (oldószerrel extrahált) 1,0% Állati pepton .1,75% 25 Ammóniumszulíát 0,4% Vízzel 100%-ra kiegészítve. A táptalaj pH-ját.10 n nátriumhidroxid-oldattal 7,5-re beállítjuk, majd hozzáadunk 0,5 súly/ 30 térfogat% kalciumkarbonátot. A fenti táptalajból 12 litert beadagolunk egy 30 literes fermentorba. A táptalajt 90 percig 121 C°-ra hevítve sterilizáljuk, majd hagyjuk lehűlni és beoltjuk 10 ml, az első lépésből (I. lé-35 pés) származó nátriumheptadecilszulfátos Bacillus circulans NRRL B—3313 szuszpenziójával. Az elegyet keverés és 6 liter/perc levegőztetés közben 33 órán át 28—30 C°-on inkubáljük. Ezalatt az idő alatt részletekben, a szükségletnek 40 megfelelően, 400 ml propilénglikol habzásgátlószert adunk hozzá a habzás csökkentésére. III. lépés: 56,8 liter tenyésztáptalajt, melynek összetétele a II. lépésben leírttal azonos 4g (pH = 7,5) egy 113,5 literes fermentorban hővel sterilizálunk, majd lehűtjük és beoltjuk 400 ml növekedésbein levő 33 órás tenyészettel, amely a II. lépésből származik. A beoltott táptalajt 177 liter/perc levegőztetés közben 32 órán keresztül. 50 28—30 C° hőmérsékleten inkubáljük. A szükségletnek megfelelően polipropiléngliköl. habzásgátlószert adunk hozzá. IV. lépés: 1135,6. liter tenyésztáptalajt, mely-55 nek összetétele a II. lépésben felhasználttal azonos (pH = 7,5) hővel sterilizálunk, majd lehűtjük és beoltjuk 56,8 liter a III. lépésből származó növekedésben levő 32 órás tenyészettel. Az elegyet 1254,5 liter/perc levegőztetés közben 24 60 órán keresztül 29—31,5 C° hőmérsékleten inkubáljük. A szükségletnek megfelelően polipropiléngliköl habzásgátlószert adunk hozzá. V. lépés: a II. lépésben leírt összetétellel te-65 nyésztaptalajt készítünk, amely még 4,0 súly/tér-9
