157972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás elsősorban tejfehérjét kicsapó vagy elsősorban proteolitikus hatású enzim-készítmények előállítására a Mesentericus-subtilis csoportba tartozó baktériumokkal
5 157972 Más területeken való felhasználás céljából a tenyészet proteáz-tartalmú szűrletét tovább kell kezelni és szükség szerint tisztítani. Gyógyászati célra használható tiszta termék előállítása céljából az enzimet ammóniumszulfáttal, tanninnal, vagy szerves kicsapószerekkel, így acetonnal, etilalkohollal, izopropilalkohollal stb. kicsapjuk. Az acetonos kicsapássál kapott terméket pl. 1%-os NaCl-oldattal extraháljuk, ismét kicsapjuk, majd szárítjuk. A tenyészet szűrletét kicsapás előtt dialízissel is tisztíthatjuk. A mosószer- és takarmány előállítása céljára az enzim nyers állapotban, tisztítás nélkül kicsapva is megfelel. Az enzim kicsapását a WP 12 090 számú keletnémet szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal közelebbről szemléltetjük. 1. példa A Mesentericus-subtilis csoport egy aktív törzsét lefölözött friss tejbe átoltjuk és 30 °C-on mint álló tenyészetet inkubáljuk. 30—40 óra inkubálás után a tenyészetet ugyancsak lefölözött friss tejet tartalmazó rázott lombikba átoltjuk. Ha a tej a meginduló peptonizáció során a rázott kultúrában 108 csíra/ml csíraszámot elér, akkor ezt az anyagot mint inokulumot a- következő összetételű termelő táptalajhoz használjuk: 20% friss tej, 1% zabdara, 1% búzakorpa, 1% árpadara, 0,01% KHJPO/,, 0,05% (NH^SO«, 0,01% MgSO/,. Sterilizálás után a pH-érték: 6,7—7,2. , A szükséges oltóanyagmennyiség előnyösen 0.5—5%. A fermentációhoz 500 ml-es talpas gömblombikokat használunk, amelyekben 150 ml táptalajt töltünk. A beoltás után a tenyészeteket 24 órán át 220/perc kilengésű rázógépen inkubáljuk. Ezt követően a mintákat kivesszük és azok tejfehérjét elválasztó hatását soványtejben, az idő függvényében megállapítjuk. 2. példa Ha a tenyésztő oldatban mosószer- és takarmány-gyártáshoz vagy a proteáznak a gyógyászatban való felhasználásához kiváltképpen proteolitikus hatású enzimet akarunk előállítani, akkor az 1. példában ismertetett termelő táptalaj összetételét a következőképpen változtatjuk meg: 1% árpadara, 0,8% búzakorpa, 0,7% zabdara, 1,2% nyers reszelt burgonya és 0,01% CaCl2 . A fenti termelőközeg beoltásához olyan inokulumot használunk, amelyet lefölözött friss tejben kb. 20 órán át 220/perc kilengésű rázógépen rázattunk. Az elért csíraszám kb. 108 csíra/ml volt. A szükséges oltóanyag-mennyiség kb. 5%. 3. példa A fermentációhoz 500 1 térfogatú V2 A acéltartályokat használunk, amelyekben keverés 5 közben (100—300 ford/perc) előnyösen 110— 120 °C-on, 30—60 percen át a következő öszszetételű tápfolyadékot sterilizáljuk: 1% árpadara, 1% zabdara,: 20% lefölözött 10 friss tej, 0,5% ' burgonyakeményítő, 0,02% CaCQj, 0,01% ,MgS04 . A pH-érték a sterilizálás után 6,5—7,0. A tápfolyadékot az 1. példa szerint kapott 15 oltóanyaggal oltjuk be. A fermentációs tartályban 200—300 1 tápfolyadék van, amelyet keverés (100—250 ford./perc) közben levegőztetünk. Az eltávozó levegő-vezetékben mért levegő-mennyiség előnyösen 70—120 l/perc. 20 A fermentáció" alatt habzásgátlóként növényi vagy állati olajokat, ill. zsírokat vagy szilikonalapú habzásgátlókat használunk. 25 Az enzimképződés maximuma (10 000— 20 000 egység/ml) 18—28 óra múlva következik be. Ezt követően a tápfolyadékot szűrjük és a szűr letet vákuumbepárlóban 25 °C-on 1:10 arányban, vagy szükség esetén még jobban be-20 pároljuk, és 1:10 000—1:20 000 aktivitású koncentrátum vagy 1:100 000 oltóerősségű kicsapott termék alakjában a tejfeldolgozás rendelkezéséré bocsátjuk. 35 4. példa A 3. példában leírtak szerint járunk el a következő összetételű táptalajt használva: 1% ár-40 padara, 1% zabdara, 1% búzakorpa, 1% reszelt nyers burgonya, 0,05% kukoricaáztatóvíz (50% szárazanyag), 0,2% glukóz és 0,01% CaCl2 . 45 Az inokulum kb. 20 órás, rázógépben inkubált tenyészet lefölözött friss tejben. Az oltóanyag felhasználása előtt barna színű és a csíraszám 3xl08 ml. A pH-érték célszerűen 6,3— 6.6. Az V2A 500 l-es acéltartályon áthaladó le-50 vegő mennyisége 300 ford./perc keverés mellett 1:0,1—1:0,3/perc, vagyis 100 1 tápfolyadékra percenként 10—30 1 levegő jut. 55 A maximális enzimmennyiség elérése után a fermentációt befejezzük és a tenyésztőfolyadékot a baktériumoktól, lebegő és szilárd anyagoktól elválasztjuk. Ezt követően a folyadék térfogatát kíméletes körülmények között csök-60 kentjük, az enzimet 4 °C-on acetonnal kicsapjuk és szárítjuk. Az így kapott termék a mosószergyártásban és takarmánykészítésben használható. Gyógyászati alkalmazásra a proteolitikus enzimkészítmény további tisztításra 65 szorul. 3
