157970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum-komplex előállítására
7 157970 8 A mikroorganizmust előnyösen folyékony táptalajon, aerób körülmények között, 23—37 C°, célszerűen 28 C° hőmérsékleten, 60—160 óra időtartamon át tenyésztjük. A pH-érték az alkalmazott fermentációs táptalaj függvényében 6—9 között váltakozhat. Szénforrásként glukóz, keményítő, dextrin, különböző lisztek (szója-, kukorica-, búzaliszt stb.), gabonaáztatólé, és más szokásosan használt anyagok alkalmazhatók. Nitrogénforrásként a fent említett nitrogén-tartalmú komplex anyagokon kívül kazein, kazeinhidrolizátum, gyápotmagliszt és ammóniumsók (szulfátok, foszfátok, kloridok) és más egyébként szokásos anyagok alkalmazhatók. Az antibiotikum előállításához alkalmazott ásványi sók az alkalmazott táptalaj függvényében változnak. A kalciumkarbonát csaknem mindig jelen van, ezenkívül kloridok, szulfátok, foszfátok stb. (nátrium, kálium, magnézium, vas, réz, cink, mangán és kobalt kationokkai) adagolhatok. A fermentációt végezhetjük Erlenmeyer-lombikokban, és különböző térfogatú laboratóriumi vagy üzemi fermentorokban. Ha a fermentáció befejeződött, az antibioitikum-komplexet alkalmas oldószerrel megfelelő körülmények között extiaháliuk a tenyészfolyadékból, és kromatografáló oszlopra való adszorbeáltatással szétválasztjuk az antibiotikumokra. Az antibiotikum-komplex koncentrációjának meghatározását a tenyészfolyadékban, a mikroorganizmus növekedési periódusa alatt úgy végezzük, hogy mintákat veszünk, a nedves micélium etanollal való extrahálásával. Az oldószer vákuumban való ledesztillálása után a maradékot megfelelő oldószer (etanol, metanol, dimetilformarnid) minimális mennyiségében felvesszük, majd vízzel hígítjuk. Ezeket a mintákat az antibiotikum-komplex iránt érzékeny mikroorganizmusokra — például Rhabditis macrocera-ra és Saccharomyces carlsbergiensis-re — vizsgáljuk meg; ennek során a vizsgálandó mintából hígítás-sorozatot állítunk elő, és ezeket az antibiotikum-komplex ismert titerű oldataival hasonlítjuk össze. Hasonló módon titrálhatók a további tisztítási .műveletek során kapott minták. Fiziokémiai tulaj donságok. Az axenomicin - antibiotikum-komplex két iinyagból áll, amelyek fiziokémiai tulajdonságai hasonlók. Ezeket az anyagokait axenomicin A-nak és axenomicin B-nek nevezzük. Ezek sárgásfehér amorf termékek; benzolban és petroléterben nem oldhatók; vízben, etilacetátban, acetónban és kloroformban nehezen oldhatók; etil-, metil-, és propil alkoholban oldhatók. Redukálják a Fehling-oldatot és az ammóniás ezüstnitrát-oldatot, és reagálnak tetrazolkékkel. A Mólish-reakció envhén pozitív. Az anilinftaláttal aldózra és naftorezorcinnal ketózra mutató cseppreakciók negatívak. A ferriklorid-reakció negatív. Az axenomicin A elementáranalízis során' a következő értékeket adja: C 61,74%, H 8,52%, O 28,87%. A mólsúly 1451,3. A vegyület 127—142 C°-on olvad átlátszó téglavörös gél képződése 5 közben. [a]^°D = +10,5° <c = 0,9 metanolban), R/ = 0,49 pH 7-re pufferolt szilikagélben (n-butanol: ecetsav: víz = 4:0,5:1). A metanolban felvett UV-sprektrumok ab-10 szorpciós maximumokat mutatnak 249, 254 és 330 nut-nál, és „vállat" 265—268 m,«-nál. A KBr-ban felvett IV-sprektramban a következő hullámhosszúságoknál (^-ban) figyelhetők IS meg sávok: 2,94; 3,44; 5,78; 6,00; 6,16; 6,24; 6,88; 7,25; 7,41; 8,61; 8,85; 9,35; 10,00; 10,40; 10,95; 11,80; 12,50. Az axenomicin B elementáranalízise a követ-20 kező értékeket szolgáltatja: C 62,8%; H 8,58%; O 27,8%. A molekulasúly 1330,2. A vegyület 122—140 C°-on olvad. [a ] 2 3° D = +5 0 (c = 0,9 metanolban), R/ = 0,61 pH 7-re pufferolt szilikagélen (n-butanol : ecetsav : víz = 4 : 0,5 :1). 25 A metanolban felvett UV sprektumok a következő hullámhosszúságoknál mutatnak abszorpciós maximumokat: 249, 254 és 330 m/i; 265—268 rn^-nál „váll" figyelhető meg. A KBr-30 ban felvett IV-spektrumban a következő hullámhosszaknál jelennek meg sávok (^-ban): 2,94; 3,40; 5,82; 6,00; 6,16; 6,24; 6,86; 7,25; 7,41; 8,60; 8,85; 9,35; 10,00; 10,40; 10,98; 11,80; 12,50. 35 Féreggátló aktivitás A féreggátló aktivitást „in vitro" mértük különböző férgekkel, különböző kísérleti körülmények között. 40 Laboratóriumban fenntartott Rhabditis macrocerca-t élesztőkivonatos agáron tenyésztettünk, amelyet különböző koncentrációjú antibiotikummal kezeltünk. 45 Megfelelő tenyésztés után meghatároztuk az MHD-t (a minimális antibiotikum-dózist), amely teljesen meggátolja a vizsgált mikroorganizmus kifejlődését. 50 Kísérletesen fertőzött egerekből vett Syphacia obvelatá-t és Hymenolepís nana-t 7,5 pH-értéfcre pufferolt nátriumklorid-oldatokba helyeztünk. Különböző koncentrációjú antibiotikumot adagoltunk. Különböző érintkezési idők után 55 megvizsgáltuk, a két féreg-speciesből mennyi maradt még életben, és meghatároztuk az MID~t (minimális bénító dózist), azt a legkisebb anyagmennyiséget, amely a vizsgált organizmus „in vitro" mozgásának meggátlására ké-60 Pes A II. táblázatban a minimális gátló dózis és a minimális bénító dózis értékeit adjuk meg, amelyeket 4 órás érintkezési idő után határoz-65 tunk meg. 4
