157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására
19 157957 20 rózhatjuk meg: Megfelelő mennyiségű szérum-, vagy egyéb biológiai folyadékmintát veszünk, majd egy kapszulába töltött reagens-elegyet megfelelő mennyiségű vízben oldunkr Így olyan .folyékony reagenst kapunk, amely egy szé-Minthogy egy kapszula reagenselegy megfelelő mennyiségű alfa-ketonglutársavat, aszparaginsavat és almasav-dehidrogenázt tartalmaz, a reakció mértéke kizárólag a szérumban jelenlevő glutaminsav-oxálecetsav-transzamináz (GOT) aktivitásától függ. A reakció során a GOT aktivitásával arányos mennyiségű DPN képződik. Ha a mintát megfelelő spektrofotométerbe helyezzük és az optikai sűrűséget 340 m/t-nál meghatározott időközönként leolvassuk, meghatározhatjuk a DPNH átalakulási sebességét, amelyből a GOT aktivitását kiszámíthatjuk. 4.- példa Szérumban jelenlevő tejsav-dehidrogenáz (LDH) meghatározására a következő összetételű, száraz keverékeket állítjuk elő-: Puffer: dinátriumhidrogénfoszfát és káliumdihidrogénfoszfát Szubsztrátum: nátriumpiruvát Koenzim: DPNH Stabilizálószer: mannit Nagymennyiségű kapszulás készítmény előállítására az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagenselegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A példában megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. Az eljárás első lépésében száraz pufferelegyet állítunk elő az alábbi komponensekből: dinátriumhidrogénfoszfát 200— 400 g káliumdihidrogénfoszfát 40— 80 g mannit 1000—2000 g A komponenseket megfelelő berendezésben, pl. golyósmalomban, finom porrá őröljük. A komponenseket gondosan elegyítjük, majd a kapott elegy kis mintáját megfelelő mennyiségű vízben oldjuk. Az így kapott oldat pH-jának 7,4 és 7,6 értékek közé kell esnie. Ellenkező esetben az első két komponens bármelyikéből megfelelő mennyiséget adunk az elegyhez, A pufferelegyet a teljes nedvesség eltávolításáig nedvességmegkötő szer, pl. foszforrumminta egyszeri meghatározására elegendő mennyiségű és aktivitású komponenseket tartalmaz. A szérummihtát a folyékony reagenssel elegyítjük. A következő reakciók mennek végbe: pentoxid jelenlétében 50 C°-on vákuumban szárítjuk. Az alábbi komponensekből koenzim- és szubsztrátum-elegyet állítunk elő: nátriumpiruvát ' 2,7—4 g DPNH 6—8 g Az optimális mértékű reakció biztosítása szempontjából döntő jelentőségű a nátriumpiruvát mennyisége. Ennek megfelelően a bemérendő nátriumpiruvát mennyiségét kísérletsorozattal gondosan meg kell határoznunk. A kísérletek elvégzéséhez a következő komponensekből oldatsorozatot állítunk elő: foszfátpuff er 1,0 g fenti foszfát--por/10 ml 2,8 ml DPNH 4 mg/ml 0,1 mg szérum 0,1)20 ml A foszfátpuffert úgy állíthatjuk elő, hogy 1 g fenti módon előállított puffer-elegyet 10 ml vízben oldunk. A DPNH oldat előállítása során kb. 4 mg DPNH-t 1 ml vízben oldunk. Enzimforrásként megfelelő mennyiségű tejsav-dehidrogenázt tartalmazó szérumot alkalmazunk. 32 mg nátriumpiruvátot 10 ml vízben oldunk. A szérumot, DPNH- és puffer-oldatot egyesítjük, esi a kapott vizsgálandó oldathoz megfelelő mennyiségű, pl. 0,05 ml nátriumpiruvátóldatot adunk. Az oldat optikai sűrűségét 340 m^-nál meghatározott időközönként megmérjük és feljegyezzük. Ezután a fenti kísérletet növekvő mennyiségű nátriumpiruvát-oldatok felhasználásával'-(pl. 0,10 ml, 0,15 ml, 0,20 ml stb.) megismételjük, az oldatok optikai sűrűségét meghatározott időközönként megmérjük és feljegyezzük. Ezt a műveletet a 340 niu-nál mért optikai sűrűség optimális változási sebességének meghatározásáig folytatjuk. A fenti kísérletsorozatból meghatározhatjuk az optimális változási sebesség kiváltásához szükséges nátriumpiruvát mennyiségét. Ezután az elegyhez a meghatározott mennyiségű nátriumpiruvátot és DPNH-t adjuk. A DPNH mennyiségét a reagensből és mintából álló elegy optimális optikai sűrűségének megfelelően választjuk meg. Általában olyan mennyiségű DPNH-t alkalmazunk, amely az elegyben kb. 0,8—1,0 optikai sűrűségértéket biztosít 340 ( MD 15 2C 30 35 40 45 50 55 60 65 GOT alfa-ketoglu társav + aszparaginsav — • glutársav + oxálecetsav oxálecetsav + DPNH — : * almasav + DPN 10
