157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

157997 21 .22 m/t-nál. A nátriumpiruvát és DPNH bemérése után az elegyet megfelelő berendezésben, pl. golyós malomban finoman porítjuk és elegyítjük, majd a reagens-elegyet vákuumban szárítjuk. A fenti eljárással olyan száraz porkeveréket kapunk, amely nátriumpiruvát-szubsztrátumot és redukált difoszfopiridin-nukleotidot tartalmaz pl. mannittal együtt. A porkeverék száraz állapotban rendkívül stabil és hosszú ideig eltartható. A keverékét ezután egy szérumminta egyszeri meghatározására alkalmas adagokra osztjuk. Az adagokat a felhasználásnak megfelelő tartályokba, pl. kapszulákba tölthetjük. Célszerűen minden esetbén azonos méretű kapszulákat alkalmazunk. A kapszulákat úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb menynyiségű adag befogadására is megfeleljenek. A reágens-elegyhez olyan mennyiségű töltő és stabilizáló anyagot, pl. marinitot adunk, amely a kapszulát teljesen kitölti. Szérumok tejsav-dehidrogenáz tartalmát egy kapszula reagens-elegy segítségével a következőképpen határozhatjuk meg: A szérumból megfelelő mennyiségű mintát veszünk. Egy kapszulába töltött reagens-elegy adagot megfelelő mennyiségű vízben oldunk. így egy szérumminta egyszeri meghatározására alkalmas mennyiségű reagensoldatot kapunk. A folyékony reagenst a vizsgálandó mintával elegyítjük. Azonnal megindul a következő reakció: T DH piroszőlősav + DPNH -* tejsav + DPN A reakció csupán a szérumban jelenlevő tejsav-dehidrogenáz enzim katalizáló hatásától függ. Ennek megfelelően a DPNH DPN-né alakulásának mértékét kizárólag a mintában jelenlevő tejsav-dehidrogenáz enzim mennyisége és aktivitása határozza meg. 5. példa Szérumban jelenlevő tejsav-dehidrogenáz enzim meghatározására az alábbi összetételű száraz elegyet állítjuk elő: Puffer: glicin és nátriumkarbonát Szubsztrátum: litiumlaktát Koenzim: dif oszf opiridin-nukleotid (DPN) Stabilizálószer: mannit Nagv mennyiségű kapszulás készítmény előállításához az alábbi közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagens-elegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva standard méretű kapszulákba tölthetünk. A példában megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. Az eljárás első lépésében az alábbi komponensekből száraz pufferelegyet állítunk elő. glicin 180— 313 g nátriumkarbönát 80— 120 g mannit 1000—2000 g A komponenséket megfelelő berendezésben, pl. golyós malomban finom porrá őröljük. A finom őrleményeket elegyítjük, majd a kapott porkeverék kis mintáját megfelelő mennyiségű vízben oldjuk. A kapott oldat pH-jának kb. 8,4—8,6 tartományba kell esnie. Ellenkező esetben a fenti első két komponens egyikének hozzáadásával az elegy pH-ját a kívánt értékre állítjuk be. A pufferelegyet ezután a teljes nedvességmennyiség eltávolításáig nedvességmegkötőszer, pl. foszforpentoxid jelenlétében kb. 40 C°-on vákuumban szárítjuk. A következő komponensek elegyítésével koenzim- és szubsztrátum-porkeveréket állítunk elő: litiumlaktát 50—100 g DPN 30— 40 g Az optimális mértékű reakció biztosítása szempontjából döntő jelentőségű a litiumlaktát mennyisége. Ennek megfelelően a bemérendő litiumlaktát mennyiségét kísérletsorozattal gondosan meg kell határoznunk. A kísérletek elvégréséhez a következő komponensekből oldatsorozatöt állítunk elő: glicin-nátriunlkarbonát puffer (1 g fenti módon előállított por/10 ml víz 2,8 ml DPN 33 mg/ml víz 0,1 ml szérum 0,020 ml A pufferoldatot úgy állíthatjuk elő, hogy 1,0 g fenti módon előállított glicin-nátriumkarbonát pufferelegyet kb. 10 ml vízben oldunk. A DPN oldat előállítása során kb. 33 mg DPN-t 1 ml vízben oldunk. Enzimforrásként megfelelő mennyiségű tejsav-dehidrogenázt tartalmazó szérumot alkalmazunk. Kb. 750 mg lítiumlaktátot kb. 10 ml vízben oldunk. A szérumot, DPN- és puffer-oldatot egyesítjük, és a kapott vizsgálandó oldathoz megfelelő mennyiségű, kb. pl. 0,05 ml laktátoldatot adunk. Az oldat optikai sűrűségét 340 m/i-náí meghatározott időközönként leolvassuk és feljegyezzük. Ezután a fenti műveletet növekvő mennyiségű (pl. 0,10 ml, 0,15 ml, 0,20 ml, stb.) litiumlaktát-oldat alkalmazásával megismételjük. Az oldatok optikai sűrűségét 340 m/,t-nál időközönként leolvassuk és feljegyezzük. Á műveletet addig folytatjuk, amíg a 340 m/tnál mért optikai sűrűség ontimális változási sebességét előidéző litiumlaktát-oldat pontos mennyiségét meg nem határoztuk. Az optimális optikai sűrűségváltozási sebességet kiváltó litiumlaktát mennyiségét a fenti módon határozhatjuk meg. Az így meghatározót m^nnvisáCTű litiumlaktát és a DPN-t ezután a reagens-elegyhez adjuk. A DPN szükséges mennyiségét ugyancsak a fenti eljárásié 15 20 £5 :0 35 40 45 50 55 60 11