157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

157957 aim asav-dehidrogenáz gumiarábikum trisz-EDTA-puffer 3—5X10G

egység 2—10 g 1— 4 ml A gumiarábikumot megfelelő mennyiségű vízben, (kb. 50 ml) oldjuk, és hozzáadjuk az almasav-dehidrogenáz-, ül. trisz-EDTA-oldatot. Az elegyet gondos keveréssel homogenizáljuk, és a kapott oldatból vákuumkezeléssel eltávolítjuk a levegőt. Ezután az oldatot fagyasztjuk, és vákuumban eltávolítjuk az. összes nedvességet. így olyan száraz, liofilizált porkeveréket kapunk, amely az almasav-dehidrogenáz-enzimet az enzim aktivitásának megmaradását biztosító stabilizátorokkal együtt tartalmazza. Ezután meghatározzuk a liofilizált porkeverékben levő almasav-dehidrogenáz enzim aktivitását. A meghatározáshoz az alábbi anyagokat használjuk fel: 20 oxálecetsav, 1 mg/m! 0,1 ml DPNH, 2-mg'ml 0,1 ml foszfátpuffer, 0,1 M, pH = 7,5 2,7 ml Előállítjuk a megadott koncentrációjú oldatokat, majd az oldatok elegyéből meghatározásra alkalmas folyékony reagenst készítünk. Megfelelő mennyiségű almasav-dehidrogenáz enzimet tartalmazó liofilizált porkeveréket vízben oldunk (így pl. 20 mg porkeveréket 20 ml vízben oldunk fel). A kapott oldatból kb. 0,02 ml-t a reagensekhez adunk. Azonnal megkezdődik a DPNH átalakulása DPN-né. A reakció lezajlása során az oldatot megfelelő spektrofotométerbe helyezzük, és a reagens optikai sűrűségét meghatározott időközönként, pl. percenként leolvassuk. Több leolvasás után átlagot számolunk, amely a liofilizált porkeverékben levő almasavdehidrogenáz enzim aktivitására jellemző értéket ad. Az optikai sűrűség 0,001/perc sebességű változása 1 egységnyi aktivitást jelez. így meghatározhatjuk a liofilizált porkeverékben levő almasav-ddhidrogenáz enzim aktivitását, amelynek célszerűen a 8—20-10" egység tartományba kell esnie. Ezután az almasav-dehidrogenáz enzimet tartalmazó liofilizált készítményt az alább felsorolt anyagokkal elegyítve kapszulákba tölthetjük: L-aszparaginsav alfa-ketoglutársav dinátrium-hidrogénfoszfát nátriumkarbonát mannit DPNH. liofilizált porkeverék 220— 260 g 50— 60 g 200— 600 g 140— 280 g 800—2000 g 6— 8 g 8—20-10" egység K'A alfa-aszparaginsavat, alfa-etoglutársavat, dinátrium-hidrogénfoszfátot és nátriumkarbonátot elegyítjük és megfelelő berendezésben, pl. golyós malomban kb. 6—10 órán át őrölve finom porrá alakítjuk. A kapott finom porból kb. 100 mg-ot megfelelő mennyiségű — pl. 5 ml — vízben feloldunk. A kapott oldat pH-jának 7,4 és 7,6 értékek közé kell esnie. Az oldat pH-értiké; megfelelő mennyiségű" nátriumkarbonát hozzáadásával növelhetjük, ül. megfelelő meny-5 nyiségű alía-aszparaginsav és alía-katoglutársav hozzáadásával csökkenthetjük. Az őrlést megismételjük, majd a keveréket megfelelő berendezésiben, pl. golyós malomban mannittal elegyítjük, végül íosziorpentoxid jelenlétében, 10 40 C°-on vákuumban szárítjuk. Az így kapott por keverék pH-ja a kívánt tartományba esik. Rendkívül fontos, hogy a porkeveréket ne érje nedvesség. Általában elő-15 nyösen járunk el oly módon, ha a porkeveréket 15%-os relatív légnedvességet meg nem haladó nedvességű helyiségben tároljuk. Ezután az elegyhez a fent megadott mennyiségű DPNH-t, és számított mennyiségű almasav-dehidrogenázt tartalmazó liofilizált porkeveréket adunk. A beadagolt DPNH mennyiségét úgy választjuk meg, hogy ha a kapott elegy tízezredrészét 3 ml vízben oldjuk, a képződött oldat optikai sűrűsége 340 m/t-nál 0,8 és 1,0 ér-2b tékek között legyen. Ezzel az intézkedéssel a meghatározások elvégzését könnyíthetjük meg. A kapott elegyet ezután golyósmalomban őröljük. 30 A fenti eljárással olyan reagens-elegyet kapunk, amely az almasav-dehidrogenáz enzimet gumiarábikum, trisz-EDTA, ammóniumszulfát és etüéndiamintetraecetsav stabilizátorokkal együtt tartalmazza. A stabilizálószerek a ké-35 szítmény tárolhatóságát hosszú ideig biztosítják az enzim aktivitásának csökkenése nélkül. A reagens-elegy továbbá dinátrium-hidrogénfoszfát puffert és alfa-aszparaginsav + alfa-ketoglutársav szubsztrátumot tartalmaz, ame-40 lyek a vizsgálat végrehajtásakor a kívánt reakció lezajlását biztosítják. A kapott reagens-elegy kis mintáját megvizsgáljuk. A minta kivételekor ügyelnünk kell arra, hogy az elegy ne érintkezzen nedvességgel. A kísérlet során 45 az elegyből készített oldat optikai sűrűségét, a DPNH eloszlását, továbbá a glutaminsav-piroszőlősav-transzamináz' meghatározásakor mutatott aktivitást mérjük. Ezután á reagens-elegyet egy minta egyszeri meghatározására al-50 kalmas adagokra osztjuk, és az adagokat megfelelő tartályokba, pl. kapszulákba töltjük. Ha gyógyszerészeti zselatinkapszulákat alkalmazunk, a kapszulák csomagolásakor szárítószert, pl. alumíniumoxid-tablettát helyezünk a kap-55 szulák közé. A reagens-elegyeket az aktuális adagmennyiségtől függetlenül célszerűen standard méretű kapszulákba töltjük. Ennek megfelelően a kapszulák méretét úgy választjük meg, hogy a legnagyobb adag befogadására is 6Ó alkalmasak legyenek. A reagens-elegyhez olyan mennyiségű töltőanyagot, pl. mannitot adhatunk, hogy a kapszulát teljesen kitöltse. A szérumok glutaminsav-oxálecetsav-transzamináz (GOT) tartalmát egy kapszula reagens-65 -elegy segítségével a következőképpen hatá-