157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

15 157957 16 rostyánkősav, aszparagüisav, glutaminsav és pl. nátrium-, kálium-, lítium sóik, glicilglicin-és glicin. A puffer-elegyek általában száraz porkeverékek. A puff erek alkalmazásának egyik célja az, 5 hogy a reagensből és a vizsgálandó mintából álló elegyben a reakció lezajlása szempontjából optimális pH-viszonyokat biztosítsák. A reagens-elegyben alkalmazott szubsztrá- 10 tumok minősége természetesen a kiváltandó reakciótól függ. Általában olyan szubsztrátumokat alkalmazunk, amelyek kémiai reakcióit a korábban felsorolt enzimek katalizálják, és amelyek a mérendő aktivitású enzimeknek 15 megfelelnek. A, szubsztrátumokat ugyancsak száraz porrá alakítjuk, s ezután elegyítjük a. puffer-eleggyel. A koenzimek minősége szintén a reakció típusától függ. A koenzimek előnyösen a példa első részében említett koenzimmel 20 azonos típusúak. Így biztosítható, hogy valamennyi reakció optikai sűrűségváltozást idéz elő a mintában előre meghatározott hullámhossztartományban. A reagens-elegy készítéséhez pl. olyan piridin-nukleotid-típusú koenzi- 25 meket használhatunk fel, amelyek kb. 340 m/,/, hullámhossztartományban abszorbeálnak. A koenzimeket porított szilárd formában használjuk fel. Ennek megfelelően, a reagens-ele gyet a porított pufferek, szubsztrátumok és 30 koenzimek elegyítésével állíthatjuk elő. Nyilvánvaló, hogy az elvégzendő méréstől (pl. enzim aktivitásának meghatározása) függetlenül mindig száraz, szilárd reagens-elegyeket kell előállítanunk. Az anyagokat kiszerelés előtt finoman porítjuk. A finom porítás azt is biztosítja, hogy a reagens-elegy vízben könynyebben oldódik. A reagens-elegyek térfogatát a korábban említett töltőanyagok hozzáadásával előre meghatározott standard értékre állíthatjuk be. Így biztosíthatjuk, hogy minden adag-egység mérete azonos lesz. Azt találtuk továbbá, hogy a töltőanyagok hatékonyan növelik a találmány szerinti reagens-elegyek stabilitását. Számos egyéb tulajdonságuk közül legfontosabb a nedvességmegkötő képességük, mert így megóvják a reagenseiégyet a vízzel való érintkezéskor bekövetkező bomlástól. A töltőanyagok továbbá egyes szubsztrátumok, így pl. az oxálecetsav stabilizálását is elősegítik. Az oxálecetsav különösen kb. 7,5 pH-jú oldatban rendkívül labilis vegyület. A korábban említett töltőanyagok alkalmazásával azonban az oxálecetsavat nagymértékben stabilizálhatjuk, és az egyéb reakciókomponensekkel összeférhetővé tehetjük. A. töltőanyagok felhasználásával továbbá az oxálecetsavat könnyen kezelhető és felhasználható formába hozhatjuk. Nyilvánvaló, hogy a töltőanyagokkal elegyített oxálecetsav a találmány szerinti reagens-elegyekben felhasználható, s különösen almasav-dehidrogenáz meghatározására alkalmas. Azt találtuk továbbá, hogy töltőanyagok felhasználása esetén a reagens-elegyek gyorsabban oldódnak vízben, s így a homogén oldat előállításához szükséges keverési és rázási idő lecsökken. Az utóbbi reagens-elegyek ugyancsak többféle kiszerelésben, így pl. fémfóliákba vagy kapszulákba töltve kerülhetnek forgalomba. Valamennyi adag egy, ill. meghatározott szá rnú mérés elvégzéséhez szükséges mennyiségű reagens-elegyet tartalmaz. A mérés elvégzésekor egy reagenselegy-adagot standard mennyiségű vízben oldva folyékony reagenst állítunk elő. Ezt a folyékony reagenst a vizsgálandó mintával elegyítve reakciót idézünk elő. A reakció sebessége a mintában jelenlevő enzim aktivitásától függ. Minthogy minden reakcióban, a meghatározandó anyagtól függetlenül, a példa első részében ismertetett koenzimet alkalmazhatjuk, a reakció sebességét könnyen figyelemmel kísérhetjük az optikai sűrűség időnkénti mérésével. Az optikai sűrűség változásából és változásának sebességéből az eredetileg jelen volt enzim aktivitását számíthatjuk ki. 3. példa: Szérumban jelenlevő glutaminsav-oxálecetsav-transzamináz (GOT) meghatározására az alábbi komponensekből álló száraz reagenselegyet állítjuk elő: Enzim: almasav-dehidrogenáz (MDH) Puffer: dinátrium-hidrogénfoszfát Stabilizálószer: gumiarábikum és trisz-(hidroximetil)-aminometán, valamint szulfát-sója Szubsztrátum: aszparaginsav és alfa-ketoglutársav Koenzim: redukált dif oszfopiridin-nukleotid (DPNH) Töltőanyag: mannit Nagymennyiségű kapszulás készítmény, vagy egyes meghatározásokhoz elegendő mennyiségű reagens előállítására az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagens-elegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A példában megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. Az eljárás első lépésében trisz-EDTA stabilizálószert állítunk elő. Ez a puffer trisz-(hidroximetil)-aminometán, trisa-(hidroximetil)-aminometán-szülfát és etiléndiamintetraecetsav elegye, amelyet pl. az 1. példában leírt eljáráshoz hasonlóan állíthatunk elő. Ezután az almasav-dehidrogenáz (MDH) enzimet tartalmazó száraz liofilizált porkeveréket állítjuk elő az alábbi komponensek segítségével: 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8