157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására
13 157957 14 tározzuk az elegyben levő enzim aktivitását. Ezt a vizsgálatot úgy végezzük, hogy a reagenselegy kis mintáját megfelelő mennyiségű (pl. 2,9 ml) vízben feloldjuk, majd a korábban már ismertetett mérést hajtjuk végre. A reakció során bekövetkezett optikai sűrűségváltozásból meghatározhatjuk a reagens-elegyben jelenlevő enzim aktivitását. Ha a fentiek szerint kapott porkeveréket vízben oldjuk, ATP-vel reakciót adó reagens-elegyet kapunk. A reakció addig folytatódik, amíg az ATP teljes menynyisége el nem tűnik. A reakció ideje a jelenlevő enzimek aktivitásától függ. Ennek megfelelően, mielőtt az egy kapszulába töltendő reagens-ele2y mennyiségének meghatározásához először önkényesen kiválasztunk egy időtartamot (pl. 5 perc), amely alatt 'a kísérletet végre kívánjuk hajtani. A reagens-elegy adagjait ezután úgy választjuk meg, hogy a reakció a kitűzött kísérleti idő tört része alatt (pl. 3 perc alatt ) valóban végbemenjen. Ha előre meghatározott méretű kapszulákat kívánunk felhasználni, a legnagyobb reagenselegy adag mennyiségnek megfelelő méretű standard kapszulákat alkalmazunk. Miután meghatároztuk az adagok mennyiségét, a por-A fenti reakciók során tehát az ATP eltűnik, és a-TPN TPNH-vá alakul. Minthogy a kapszulában levő reagens-elegy fölös mennyiségű reagenseket tartalmaz, a reakció' kizárólag az ATP eltűnése miatt áll le. Nyilvánvaló, hogy a képződött TPNH mennyisége az eredetileg jelen volt ATP mennyiségének függvénye. A reakciókat a kísérleti idő végéig hagyjuk folytatódni, azonban a reakciók már ezelőtt végetérnek. A reakciók lezajlása után, ill. a kísérleti idő végén ismét meghatározzuk a minta optikai sűrűségét 340 m^-nál. Minthogy a képződött TPNH ebben a hullámhossz-tartományban abszorbeál, a reakció előtt és a reakció után mért optikai sűrűség különbsége a képződött TPNH mennyiségére jellemző. Figyelembe véve, hogy a képződött TPNH mennyisége kizárólag az eredetileg jelen volt ATP mennyiségétől függ, azl optikai sűrűségkülönb^ség alapján meghatározhatjuk a szérum ATP-tartalmát. A találmány szerint továbbá az előzőhöz rendkívül hasonló reagens-elegyet állíthatunk elő. Ez a reagens-elegy ugyancsak kapszulákba vagy fiolákba töltehető száraz por, amelyet előre meghatározott számú — pl. egyetlen — méréshez megfelelő adagokban szerelhetünk ki. A reagens-elegy a meghatározáshoz szükséges valamennyi komponenst tartalmazza a víz kikeverékhez standard kapszula teljes kitöltéséhez megfelelő mennyiségű töltő- és stabilizálószert, pl. mannitot adunk. A fenti módon szérumok adenozin-trofoszf át-tartalmának meghatározására nagyszámú azonos kapszulát állíthatunk elő. A reagenselegyben jelenlevő stabilizálószerek (gumiarábikum, trisz-(hidroximetil)aminometán-szulfát, ammóniumszulfát) az enzimek stabilizálására szolgálnak és biztosítják, hogy az enzimek aktivitásukat hosszú időn át megőrzik. A fizikai változást létrehozó reakció lefolyását a trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-puffer, a glükóz-szubsztrátum és a TPN koenzim biztosítja. Szérumok adenozin-trifoszf át-tartalmának meghatározását egy kapszula a fenti reagenselegy segítségével pl. a következőképpen végezhetjük: A meghatározáshoz megfelelő menynyiségű adenozin-trifoszfát-tartalmú szérumminta optikai sűrűségét 340 m,a-nál meghatározzuk. Ezután egy kapszulába töltött száraz reagens-elegyet standard mennyiségű (pl. 3 ml) vízben feloldva egy meghatározáshoz megfelelő mennyiségű folyékony reagenst állítunk elő. A folyékony reagenst a szérummal elegyítjük. Ekkor a következő reakciók mennek végbe: vételével. Egy adag reagens-elegyet vízben oldva folyékony reagenst kapunk, amely a fent ismertetett enzimreakció kiváltására képes. Ezzel a reagens-eleggyel elsősorban a mintában jelenlevő enzim aktivi|j|gát határozhatjuk meg. Ennek megfelelően a"*reagens-elegy nem tartalmaz szükségképpen enzimet. A reagenselegyben feltétlenül j eleji kell lennie legalább egy, a meghatározás alapját képező reakció kiváltására alkalmas szubsztrátumnak és egy koenzimnek, amely reakcióba lépve átalakulást szenved. A koenzim a példa első részében ismertetett koenzim lehet. Ennek megfelelően az utóbbi reagens-eleggyel kiváltott reakciót ugyancsak a 340 rna-nál bekövetkező optikai sűrűségváltozással követhetjük. Az utóbbi reagens-elegy előállítása céljából először puffer-elegyet készítünk. A puffer-elegy összetétele a kívánt reakciónak megfelelően változik. Az itt felhasználható pufferek a példa első részében ismertetett pufferekkel azonos típusúak, s pl. többértékű szervetlen „anionok sói, vagy szerves aminők sói lehetnek, a sónak megfelelő savval elegyítve. A többértékű szervetlen anionok sói pl. az alábbi vegyületek lehetnek: nátrium- és káliumfoszfátok, nátrium- és kálium-pirofoszfátok. A szerves aminők és azok sói, ill. a szerves savak és azok sói pl. az alábbi vegyületek lehetnek: trisz-(hidroximetil)aminometán, imidazol és sósavas, borostyánkősavas vagy kénsavas sóik; bo-10 20 25 ináz ít-deh 40 45 50 55 60 65 ti f-1 IC O Ki TI í-i 7 glükóz + ATP glükóz-6-P + ADP , „ , „,TMT glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz glükóz-6-P + TPN .—J • ~* 6-foszfoglükónát + TPNH 7
