157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

11 157957 12 2. példa: Biológiai mintákban jelenlevő adenozintrifoszfát (ÁTP) meghatározására a következő összetételű reagenselegyet használhatjuk fel: 5 Enzim: hexokináz és grükóz-6-foszfát-dehidrogeház Puffer: trisz-(hidroximetil)~aminometán~szukcinát 10 Stabilizálószer: gumiarábikum, trisz-(hidroximetil)-aminometán és ammóriiúmszulfát Szubsztrátum: glükóz Gyorsító: inzulin és magnéziumszuííát 15 Koenzim: TPN Töltőanyag: mannit 20 25 Nagymennyiségű kapszulás készítmény, vagy egyes meghatározásokhoz elegendő mennyiségű reagens előállítására az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagenselegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A példában megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkozhatnak. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. Az eljárás első lépésében megfelelő pufferoldatot állítunk elő. A felhasznált pufferoldat lényegében az 1. példában ismertetett pufferoldattal azonos, trisz-(hidroximetil)-aminometán és borostyánkősav elegyéből áll. Ezeket az anyagokat lényegében az 1. példában leírt módon elegyítve olyan száraz puffer-elegyet kapunk, amely vízben feloldva 7,4—7,6 pH-jú oldatot képez. Ezután a hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimet tartalmazó száraz liofilizált porkeveréket állítjuk elő az alábbi komponensek elegyítésével: gumiarábikum 50—100 g tH f,z-n^''Hfoxi"T! etü'í-prriinornetán-szulfát puffer 0,2 M pH: 7,4—7,6 75—1QC ml ammóniumszulf át ÍM pH = 7,5 Cammóniával beállítva) 75—1Ö0 ml inzulin 50—750 mg hexokináz 100 mg glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 100 mg F/losrÖT- a trisz~űiídroximetil)arninörnetán-puf- 55 fért állítjuk elő oly módon, hogy trisz-(riidroxilmetil)-aminométán-oldátot állítunk elő, és annyi kénsavat adunk hozzá, hogy 0,2 mólos 7.4—7,6 pH-jú oldatot kapjunk. Ä trisz-(hidroxilmetil)arninornetán-oldathoz ezután a fent 60 mégadott mennyiségű gumiarábikumot, arrimőniumszulfátot és inzulint adjuk, és a kapott homogén oldatból vákuumkezeléssel eltávolítjuk a levegőt. Az oldatban ezután a fent megadott mennyiségű héxökinázt és glükóz-6-fosz- 65 S5 •40 45 50 íát-dehidrogenázt mérjük be és keveréssel teljesen eloszlatjuk az enzimeket. A kapott homogén oldatot fagyasztjuk, és a teljes vízmennyiséget vákuumban eltávolítjuk. Az ismertetett eljárással száraz vagy liofilizált homogén port kapunk, amely az enzimeket tartalmazza. A szárítás után meghatározzuk a liofilizált porkeverékben levő enzimek aktivitását. A meghatározáshoz az alábbi anyagokat használjuk fel: glükózoldat 60 '//M/ml (1,0& m/100 ml) 0,5 ml trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-pufferóldat 1,0 ml magnéziumszulfát, kristályos lg/10 ml 0,4 ml TPN 10 mg/l ml víz 0,2 ml liofilizált enzimelegy 10 mg víz 1,2 ml Először a tris7.-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-pufferoldatot állítjuk elő oly módon, hogy 3,4 g, a példa első lépésében közölt módon készített puffert 100 ml vízben oldunk. A fent felsorolt többi komponenst a pufferoldathoz adva homogén elegyet állítunk elő. A kapott oldat optikai sűrűségét 340 mw-nál meghatározzuk. Ezután az oldathoz 2 /iM/ml koncentrációjú standard adenozin-trifoszfát oldatot adunk. A következőkben ismertetésre kerülő reakció végbe megy. A reakció teljes lezajlásának biztosítására az oldatot megfelelő ideig állni hagyjuk. A reakció lezajlása után ismét megmérjük az elegy optikai sűrűségét 340 m/nnál. Az optikai sűrűségértékek összehasonlításával meghatározhatjuk a reakció következtében beállt változás mértékét. Az előzőekben leírt kísérlet körülményei között 1 //M/ml koncentrációjú ATP oldat 340 /.(fn-nál 2,07-es optikai sűrűségváltozást idéz elő. Ennek megfelelően a 0,2 /tM/ml koncentrációjú standard oldat által kiváltott optikai sűrűségváltozás 0,411 Ha a mérés során ezí a:s ért.'-ket. kapjuk, az eíizimek aktivitása megfelelő, és az enzimelegy felhasználható a reagenselegy előállításához. Kapszulázás céljaira a következő összetételű elegyet állítjuk élő: trisz-(hid roximetil) aminometán-szukcmát-puffer (a fenti módon előállított termék) 100—250 g magnéziumszuliát-heptahidrát 80—120 g TPN 12— 18 g vízmentes glükóz 25—100 g liofilizált enzimelegy 80—200 g A felsorolt száraz szilárd anyagokat elegyítjük, majd alkalmas berendezésben, pl. golyós malomban hosszabb ideig, általában 24 órán át porítjuk. Az így kapott elegyet egységekre oszthatjuk és kapszulákba tölthetjük. Az adagok súlyának meghatározása céljából megha-6