157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

157957 27 28 kult DPNH mennyiségét, amelyből a mintában eredetileg jelenlevő karbamid mennyiségére következtethetünk. 7. példa 5 Biológiai mintákban előforduló kreatin kináz, kreatin foszfokináz vagy CPK aktivitásának meghatározására a következő komponensekből álló száraz porkeveréket állítjuk elő: 10 Enzim: hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz Puffer: trisz-szukcinát Stabilizálószer: gumiarábikum, trisz-(hidroximetil)aminometán-szulfát, ammónimuszulfát és cisztein Szubsztrátum: kreatin foszfát és glükóz Aktivátor: magnéziumszulfát Gyorsító: inzulin Koenzimek: adenozin-difoszfát és trifoszfopiridin-nukleotid (TPN) Inhibitor: adenozin-monofoszfát Nagymennyiségű kapszulás készítmény előállítására az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagenselegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A példákban megadott menynyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Egy kapszula 3 mi reagens előállításához elegendő. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, és azok a követelményeknek megfelelően változtazhatók. Az eljárás első lépésében a pufferoldatot állítjuk elő. A reagens-elegyben felhasználásra kerülő puffer lényegében az 1. példában leírt trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-puffereleggyel azonos, és trisz-(hidroximetil)-aminometán és borostyánkősav elegyéből áll. Az anyagokat az' 1. példában megadott módon elegyítjük, s így olyan száraz puffer-elegyet állítunk elő, amely vízben oldva 7,4 és 7,6 közötti pH-jú oldatot biztosít. A legmegielelőbb puffernek a trisz-(hidroximetil)aminornetán-szukcinát puffer rendszert találtuk, azonban bármely olyan anyagot félhasználhatunk, amely az elegy pH-ját 6,5 és 7,5 értékek között tartja. Ilyen vegyületek pl. az alkálifémfcszfátok vagy trietanolamin. Ezután az alábbi vegyületek elegyítésével hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimeket tartalmazó száraz liofilizált porkeveréket állítunk elő: 15 20 25 35 40 45 50 55 Először a trisz-(hidroximetil)aminometán-oldatol; állítjuk elő oly módon, hogy trisz-(hidroximetil)-aminometán-oldatot készítünk, és annyi kénsavat adunk hozzá, hogy 0,2 mólos 7,4—7,6 pH-jú oldatot kapjunk. A trisz-(hidroximetil)aminometán-szulfátroldathoz ezután a fent megadott mennyiségű gumiarábikumot, ammóniumszulfátot és inzulint adjuk, és a kapott homogén oldatból vákuumkezeléssel eltávolítjuk a levegőt. Az oldatba ezután a fent megadott mennyiségű hexokinázt és glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt mérjük be, a kapott homogén oldatot fagyasztjuk, és a teljes vízmennyiséget vákuumban eltávolítjuk. Az ismertetett eljárással a két enzimet tartalmazó, homogén, száraz porkeveréket kapunk. A szárítás_ után meghatározzuk a liofilizált porkeverékben levő hexokináz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimek aktivitását. A meghatározáshoz az alábbi anyagokat használjuk fel: glükózoldat 60 /jM/ml (l,0v

8 g/100 ml) 0,5 ml trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát puffer-oldat 1,0 ml adenozin-difoszfát 15 mg/ml 0,2 ml magnéziumszulfát, kristályos 1 g/10 ml 0,4 ml kreatinfoszfát 100 mg/ml 0,2 ml adenozin-monofoszfát 60- mg/l ml 0,2 ml TPN 10 mg/l ml víz 0,2 ml víz 0,4 ml liofilizált enzimelegy 10 mg ciszteinéhidroklorid 12,5 mg/ml 0,2 ml Először a, trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát-pufferoldatot állítjuk elő olymódon, hogy 3,4 g, a példa első lépésében közölt módon készített puffert 100 ml vízben oldunk. A fent felsorolt többi komponenst a pufferoldathoz adva homogén elegyet állítunk elő. A kapott oldat optikai sűrűségét 340 m/,í-nál meghatározzuk. Ezután 0,02 NE aktivitású* standard kreatin-foszfokináz oldatot adunk az elegyhez. (*1 NE az aktivitása annak az enzimnek, amely 30 C°-on 1 perc alatt 1 /;M szubsztrátumot alakít át.) Ekkor a későbbiekben ismertetésre kerülő reakció megy végbe. Megmérjük az optikai sűrűség időbeli változását 340 m^-nál, s így meghatározhatjuk a CPK aktivitását a kezdeti és végső optikai sűrűségértékek összehasonlításával. gumiarábikum 50—100 g trisz-(hidroximetil)aminometánszukcinát-puffer 0,2 M pH 7,4—7,6 75—100 ml ammóniumszulfát 1 M pH 7,5 (ammóniával beálítva) 75—100 ml inzulin 50—750 mg hexokináz 100 mg glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 100 mg 60 65 A. fenti kísérleti körülmények között 1 NE CPK 30 C°-on, 340 m^-nál 2,07/perc optikai sűrűségváltozást idéz . elő. Ennek megfelelően a kísérletben felhasznált 0,02 NE aktivitású standard oldat 30 C°-on 0,414/10 perc sebességű optikai sűrűségváltozást okoz. Ha a kísérlet során ezt az értéket kapjuk, az enzim aktivitása a további feldolgozáshoz megfelelő. 14