157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására
29 157957 30 Kapszuláé készítmény előállítására az; alábbi anyagokat elegyítjük: trisz-(hidroximetil)aminometán)-szukcinát-puffer (a fenti módon előállított termék) 100—250 g dinátrium-kreatin-íoszíát-tetrahidrát 100—200 g magnéziumszulfát, kristályos 80—120 g nátrium-adenozin-5-dif oszf át-dihidrát 15— TPN 12— adenozin-5-monof oszf át monohidrát 60—120 vízmentes glükóz 25—100 tisztein hidroklorid 5— 20 lioíilizált enzim-elegy 80—200 30 18 A szilárd poralakú komponenseket összekeverjük, majd alkalmas berendezésben, pl. golyós malomban hosszabb, időn át őrölve finom porrá törjük. A porkeveréket ezután megfelelő súlyú adagokra oszthatjuk és az adagokat kapszulákba tölthetjük. Az adagok mennyiségének meghatározásához először a reagens-elegy aktivitását kell megmérnünk. A reagens-elegy kis mintáját megfelelő mennyiségű, pl. 2,9 ml vízben oldjuk, s ezután, megismételjük a fent leírt kísérletet. A. reakció során bekövetkezett optikai sűrűségváltozásból, kiszámíthatjuk az elegyben levő enzimek aktivitását. Ha a reagens-elegyet vízben oldjuk, olyan folyékony reagenst kapunk, amely a CPK. reakciója során adenozin-trifoszfátot (ATP) fejleszt. A reakció sebessége a CPK mennyiségének növekedésével bizonyos határértékig növekszik. Az ennek eléréséhez szükséges CKP mennyiségét a reagens-elegyben levő enzimek aktivitása szabja meg. Ennek megfelelően az egy kapszulába tölthető reagens-elegy mennyiségének meghatározásakor mindenek-10 15 20 25 SO 35 40 előtt a kísérlet végrehajtásához szükséges maximális CPK-mennyiséget kell kiválasztanunk. Legyen ez az érték pl. 0,05 NE. Ekkor egy kapszulába annyi reagens-elegyet töltünk, hogy a vizsgálat során a reakció sebessége 0,05 NE-ig a CPK mennyiségével arányosan növekedjen, illetőleg a 0,05 NE CPK jelenlétében 30 C°-on mért optikai sűrűségváltozás sebessége 340 ma hullámhosszon 0,518/5 perc legyen. Az adagokat célszerűen előre meghatározott méretű kapszulákba töltjük. A standard kapszulaméretet úgy választjuk meg, hogy még a legnagyobb adag befogadására is alkalmas legyen. Miután az adagok súlyát meghatároztuk, a reagens-elegyhez annyi töltőanyagot, pl. mannitot vagy valamely, ezzel egyenértékű anyagot adunk, amely a kapszulát teljesen kitölti. A fenti eljárással szérumok, kreatin-foszfokináz (CPK) tartalmának meghatározására alkalmas kapszulás készítményeket állíthatunk elő. A trisz-(hidroximetil)-aminometán-szulfát, gumiarábikum és ammóniumszulfát stabilizálószerek az enzimek stabilitását biztosítják, s így lehetővé teszik a reagens-elegy hosszabb ideig történő tárolását az enzimek aktivitásának csökkenése nélkül. A trisz-(hidroximetil)aminometán-szukcinát puffer, glükóz szubsztrátum és TPN koezim a reakció lezajlását biztosítja. Szérumok adenozin-trifoszfát aktivitásának mérését egy kapszulába töltött reagens-elegy segítségével a következőképpen végezhetjük el: A. szérumból megfelelő mennyiségű mintát veszünk, és 340 m/j-nál megmérjük a minta optikai sűrűségét. Egy kapszulába töltött reagenselegyet standard mennyiségű, pl. 3 ml vízben oldunk. így olyan folyékony reagenst kapunk, amely egy minta egyszeri meghatározására alkalmas. A. folyékony reagenst a szérummintához adjuk. A. következő reakciók mennek végbe: kreatin-foszfokináz kreatin-íoszfát + ADP •——- kreatin + ATP hexokináz glükóz + ATP - -glükóz-6-P + ADP glükóz-6-P + TPN gm^^^é^étMrogena^^ 6_ foszfoglükonázt + TPNH A. reakciók, során ATP képződik majd eltűnik, és a TPN TPNH-vá alakul. Minthogy a reagens- * elegy a. komponenseket bőséges mennyiségben tartalmazza, a reakció sebességét kizárólag a jelenlevő CPK határozza meg. Nyilvánvaló, hogy a TPN TPNH-vá alakulásának sebessége a biológiai mintában jelenlevő CPK mennyiségétől függ. A. reagáltatást a szokásos kísérleti idő végéig (5—IC perc) folytatjuk, a reakció sebességét azonban a kísérleti idő letelte előtt is meghatározhatjuk. A kísérleti idő leteltével az elegy optikai sűrűsége 340 m/i-nál ismét meghatározzuk. Tekintettel arra, hogy a TPNH ezen a hullámhosszon fényt abszorbeál, a reakció előtt és után mért optikai sűrűségértékek különbsége a képződött TPNH mennyiségére jellemző érték. 50 55 60 Minthogy a TPNH mennyiségének időbeli változása a mintában eredetileg jelen volt CPK aktivitásának függvénye, az optikai sűrűségváltozásból kiszámíthatjuk a CPK aktivitását. A. biológiai mintákban, adott esetben jelenlevő myokináz vagy adenilát-kináz enzimek aktivitásának csökkentésére a reagens-elegyhez adenozín-monoíoszfátot (AMP) adunk. Myokináz jelenlétében ugyanis a következő reakció megy végbe: myokináz 2 ADP • ATP + AMP A. reakció során képződő ATP meghamisítaná a CPK. meghatározás eredményét, AMP adagolásával azonban meggátolhatjuk, a fenti, reakció 66 lezajlását. 15
