157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására
25 157957 26 10 15 20 25 Szubsztrátür-: karbamid (0,01 M) Koenzim: DPNH (4 mg/ml) Puffer: 0,1 m, pH — 7,5, alfa-ketoglutársavat tartalmaz Aktivátor: ADP 10 mg/ml Előállítjuk a fenti koncentrációjú oldatokat, majd azok elegyítésével a kívánt meghatározásra alkalmas vizsgálandó elegyet készítünk. Mégfelelő mennyiségű, glutaminsav-dehidrogenáz és ureáz enzimet tartalmazó liofilizált porkeveréket vízben oldunk. Előnyösen úgy járunk el, hogy 100—100 mg liofilizált porkeveréket 10— 10 ml vízben oldunk, s így két külön enzimtartalmú oldatot állítunk elő. Ezután a vizsgálandó elegyhez 0,1—0,1 ml fentiek szerint készített enzimtartalmú oldatot adunk. Az elegyítéskor azonnal megindul a DPNH DPN-né alakulása. A reakció folyamán az oldatot megfelelő spektrofotométerbe helyezzük, és meghatározott időközönként, pl. percenként leolvassuk az elegy optikai sűrűségét. Több leolvasás után átlagot számolunk, amely a liofilizált porkeverékben jelenlevő ureáz enzim aktivitására jellemző érték. Az optikai sűrűség 0,001/perc sebességű változása 1 egységnyi aktivitásnak felel meg. Az így kapott értékből kiszámítjuk azt az ureáz- és glutaminsav-dehirogenáz enzimet tartalmazó liofilizált pormennyiséget, amely 0,05 mikromól karbamiddal 5—10 perc alatt végbemenő reakciót ad. Ezután az ureázt és glutaminsav-dehidrogenázt. tartalmazó száraz, liofilizált porkeverékekhez puffer-szubsztrátumot, aktivátort és segédanyagokat adunk, és az elegyet nedvesség kizárásával őröljük és elegyítjük. A kapott reagenselegyet kapszulákba töltjük. 10 000 vizsgálat elvégzéséhez elegendő reagens-elegy előállításához a következő komponenseket elegyítjük: tri sz-(hidroxim etil)-aminometán 300— 500 g alia-keto-glutársav 50— 80 g adenozindifoszfát, nátriumsó 5— 15 g mamiit 500—1000 g DFNH 3— 6' g . liofilizált glutaminsav-dehidrogenáz 7—15 NE* liofilizált ureáz 15—40 NE* *Amint már korábban említettük, az egyes en- 50 zimek mennyiségét általában úgy határozzuk meg, hogy megmérjük a 0,05 • mikromól karbac5 40 Ab middal 5—10 perc alatt végbemenő reakcióhoz szükséges enzimmennyiséget. As: alfa-keto-glutársavat, trisz-(hidroximetil)-aminometánt, ADP-t és mannitot elegyítjük, és megjelelő berendezésben, pl. golyós malomban 6—10 órán át kezelve finom porrá őröljük. Az elegyből azután kb. 100 mg-os mintát veszünk, és megfelelő mennyiségű — kb. 3 ml — vízben feloldjuk. Az így kapott oldat pH-jának 8,0 és 8,5 között kell lennie. Ekkor olyan porkeveréket kapunk, amely a két enzimet mannittal, trisz (hidroximetil)-aminometánnal, alfa-keto-glutársavval és adenozindiíoszfáttal együtt tartalmazza. A porkeveréket 2 napig vagy hosszabb ideig vákuumban szárítjuk, s így rendkívül stabil, az enzimek károsodása nélkül hosszú ideig eltartható elegyet kapunk. Az elegyhez szárítás után, nedvességmentes körülmények között DPNH-t adunk. A DPNH mennyiségét általában úgy választjuk meg, hogy 340 m.;/-nál l-es abszorpciót idézzen elő. A porkeverék -a DPNH-n kívül tehát puffért, enzimeket, adenozin-difoszfát nátriumsót és alfa-ketoglutársavat tartalmaz, amelyek a kísérlet elvégzésekor biztosítják a reakció lezajlását. A kapott 'porkeverékei ezután egy minta egyszeri meghatározására elegendő mennyiségű folyékony reagens előállítására szolgáló adagokra oszthatjuk. Az adagokat, úgy választjuk meg, hogy azok p. kívánt aktivitású enzim-mennyiséget tartalmazzák. Az adagokat ezután megfelelő tartályokba, pl. kapszulákba tölthetjük. A csomagoláshoz az adagok súlyától függetlenül célszerűen mindig azonos méretű kapszulákat használunk fel. A kapszula méretét úgy választjuk meg, hogy az a legnagyobb anyagmennyiség betöltésére is alkalmas legyen. A reagenselegyhez adott esetben annyi töltőanyagot, pl. mannitot adunk, amely a kapszulát teljesen kitölti. Szérumok karbamid-tartalmának meghatározását egy kapszulába töltött reagens-elegy segítségével a következő módon végezhetjük el: A szérumból vagy egyéb biológiai folyadékból megfelelő menyiségű mintát veszünk. Ezután egy kapszulába töltött, a fentiek szerint előállított reagens-elegyet megfelelő mennyiségű vízben oldunk. így olyan folyékony reagenst kapunk, amely egy minta egyszeri meghatározására alkalmas. A folyékony reagenst a mintához adjuk. Az elegyítés pillanatában a következő reakciók indulnak be: karbamíd + víz NH4 ureáz -2 NH4 + + HC0 3 .. . , , ,, , „„,T „glutáraminsav-dehidrogenáz • alf a-keto-glutarsav -4- DPNH —.— -glutaminsav + DPN Minthogy a;: ali'a-ketö-glutársav, DPNH, u.reáz és glutaminsav-dehidrogená?; a kapszulában kellő mennyiségben rendelkezésre áll, a reakció mértékét kizárólag az eredetileg jelenlevő karbamid mennyisége szabja meg. így a DPN -es DPNH-vá történő átalakulása egyenesen arányos az eredetileg jelenlevő karbamid mennyiségével. A mintát; megfelelő spektrofotométerbe helyezzük, és 340 mu.-nál megmérjük a minta optikai sűrűségét. Ebből kiszámítjuk az átala-13
