157957. lajstromszámú szabadalom • Stabil, szilárd reagens-elegyek és eljárás ezek előállítására

23 157957 24 sal határozzuk meg azzal a különbséggel, hogy optimális mennyiségű litiumlaktát-oldatot mérünk be, és a DPN mennyiségét változtatjuk. A DPN oldat szükséges mennyisége általában 0,1 ml. Az előbb elkészített elegyhez számított mennyiségű litiumlaktátot és DPN-t adunk, a kapott elegyet megfelelő berendezésben, pl. golyós malomban őröljük és homogenizáljuk, majd a reagens-elegyet vákuumban szárítjuk, A fenti eljárással olyan reagens-elegyet kapunk, amely litiumlaktát-szubszt'rátumot és difoszfopiridin-nukleotid koenzimet tartalmaz pl. mannittal együtt. A kapott porkeverék száraz állapotban rendkívül stabil és sokáig eltartható. A kapott reagens-elegyet egy szérumminta egyszeri meghatározásra alkalmas adagokra oszthatjuk, és az adagokat a felhasználásnak megfelelő tartályokba, pl. kapszulákba tölthetjük. Célszerűen mindenkor, az aktuális adagmennyiségtől függetlenül, azonos méretű:

kapszulát alkalmazunk. A kapszula méretét úgy választjuk meg, hogy az a legnagyobb adagmennyiség befogadására is alkalmas legyen. A reagens-elegyhez olyan mennyiségű töltőanyagot, pl. mannitot adunk, ami a kapszulát teljesen kitölti. Szérumok tejsav-dehidrogenáz-enzim aktivitásának meghatározását egy kapszula fenti reagens-elegy segítségével pl. a következőképpen végezhetjük: Megfelelő mennyiségű szérummintát veszünk. Ezután egy kapszulában levő reagens-elegyet megfelelő mennyiségű vízben oldunk, így egy szérumminta egyszeri meghatározására alkalmas mennyiségű folyékony reagenst kapunk. A folyékony reagenst a szérummintával elegyítjük. Azonnal beindul a következő reakció : LDH tejsav + DPN -;

-piros'zőlősav + DPNH A fenti reakció mértéke a szérumban jelenlevő tejsav-deh'idrogenáz enzim katalizáló hatásától függ. Ennek megfelelően a DPN DPNH-vá alakulásának sebességét kizárólag a mintában eredetileg jelenlevő tejsav-dehidrogenáz enzim aktivitása szabja meg. 6. példa Szérumban jelenlevő karbamid és karbamidnitrogén meghatározására az alábbi összetételű száraz reagens-elegyet állítjuk elő: Enzim: ureáz és glutaminsav-dehidrogenáz Stalizálószer: ditio9ritrit+

és nátriúm-kálium-tartarát puffer: trisz-(hidroximetil)-aminometán Szubsztrátum: alfa-ketogluíársav, vagy sói Koenzim: redukált difoszfopiridin-nukleotid (DPNH) . Gyorsító: adenozin-difoszfát, nátriumsó formájában + :

A legelőnyösebb szulfhidrid-vegyületnek a ditioetirtitet találtuk, azonban egyéb vegyületeket, így ciszteint vagy glutationt is felhasználhatunk. A legelőnyösebb sónak a nátrium-kálium-tartarát bizonyult, ehelyett azonban nátriumszulfátot, -tartarátot vagy -glutamátot, ill. k;'liumszulfátot is' alkalmazhatunk. Nagymennyiségű kapszulás készítmény előállítására az alább közölt eljárás szerint meghatározott mennyiségű száraz reagenselegyet állítunk elő, amelyet kis részletekre osztva kapszulákba tölthetünk. A • példákban megadott mennyiségek 10 000 kapszula előállítására vonatkoznak. Egy kapszula 3 ml reagens előállításához elegendő. Hangsúlyozzuk azonban, hogy ezek a mennyiségek csak illusztrálásra szolgálnak, s azok a követelményeknek megfelelően változtathatók. A trisz-(ihidróximetil)-aminometán- és alfa-ketoglutársav elegyéből álló száraz puffer-szubsztrátum keverékét úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő mennyiségű alapanyagokat gondosan összekeverjük és megőröljük. Vízben feloldva a trisz-(hidroximetil)-aminometán alfa-ketoglutarátja keletkezik, mely puff érként viselkedve az oldat pH-ját a megfelelő értéken tartja. A tnsz-(hidroximetil)-aminometán igen előnyös puffersajátságokkal rendelkezik, azonban a. foszfát — glicin vagy bikarbonát pufferek is jól felhasználhatók. Az ureázt finoman őrölt kenyéría-babból állítjuk elő híg vizes nátriurnfoszí'át pufferrel (pH = 6,3—6,7) történő extrakcióval. Az extraktot a:; ammónia eltávolítása dijából dializáljuk, szűréssel tisztítjuk, ditioaritritet adunk hozzá és a kapott oldatot liofilizáljuk. Ureáz tartalmú száraz, stabil poralakú termék keletkezik. • \ A következő lépésben glutaminsav dehidrogenázt tartalmazó száraz, liofilizált port állítunk elő az alábbi eljárás szerint: Glutaminsav dehidrogenáz, 1 000 000 NE, Ditioeritrit, 300—600 mg, Nátrium-kálium tartarát, 25 ml telített oldat. A fenti reagenseket a megadott határok közötti mennyiségekben összekeverjük oly módon, hogy a glutaminsav-dehidrogenáz oldatához — melyet kívánt esetben gélszerű tornyon ammóniamentesítünk — nátrium-kálium tartarátot és dihidroeritritet adagolunk. A fentiek szerint előállított stabilizált oldatot gondosan összekeverjük, majd a bezárt levegőt vákuum-kezeléssel eltávolítjuk. Ezután az oldatot fagyasztjuk és a teljes nedvesség eltávolításáig vákuumban tartjuk. A kapott száraz liofilizált pof keverék a glutaminsav-dehidrogenázt stabilizátorokkal együtt tartalmazza, amelyek az enzim aktivitását a kívánt szinten tartják. Ay, ureáz és glutaminsav-dehidrogenáz enzimet tartalmazó liofilizált porkeverékben levő ureáz enzim aktivitását megvizsgáljuk. A kísérlethez a következő anyagokat használjuk fel: 10 15 20 25 Í(J i5 40 45 50 55 60 12