157738. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a glükózoxidáz fermentációs úton történő előállítására és tisztítására, továbbá kataláz előállítására

Tf 157738 8 Kicsapás és szárítás Az extraháló léből az enzimet kétszeres tér' fogatú izopropilalkohoIM kicsapjuk, a csapadékot szűrés után abszolút alkohollal átöblítjük és az így kapott terméket ventillációval ellátott helyiségben 28 C° hőmérsékleten szárítjuk. A drappos fehér enzimpor összaktivitása 53 290 SE. (a miceliumra 75%). Tisztítás és enzim-szétválasztás A fenti poralakú preparátumból vizes oldatot készítünk és egy mért aktivitású részét DEAE-cellulóz oszlopra felvisszük. A felvitt enzimoldat aktivitása: glükózoxidáz 2286 SE kataláz 212 BE amiláz 88,5 E A katalázt és amilázt 4,5 pH-értékű 0,07 mólos acetát-pufferral elüálva eltávolítjuk, majd a glükózoxidázt 3,7 pH-értékű 1/10 mólos acetátpufferral eluáljuk. A frakciókból kapott enzimaktivitások : glükózoxidáz 1276 SE (56%) kataláz 165 BE (78%) amiláz 68 E (76,8%) a tiszta glükózoxidáz oldatot az elválasztás után térfogatának 1/10 részére 20—32 C°-on vákuumban bepároljuk. Kataláz előállítás A fenti kataláz-amiláz-tartalmú eluátumot Sephadex G—200 oszlopra felvisszük, majd a katalázt és amilázt 5,1 pH-értékű 0,05 mólos acetát-pufferral frakcionálva eluáljuk. Az eluátumokban levő aktivitások: kataláz 138 BE (83,6%) amiláz 58 E (85,3%) 2. példa: 5% szacharózt, 2% kukoricalekvárt, 0,2% kalciumnitrátot, 0,025% káliumhidrogénfoszfátot, 0,025% magnéziumszulfátot és 0,075% citromsavat tartalmazó félszintetikus táptalajt az 1. példa szerinti inokulummal beoltunk és 500 literes fermentorban 28 C° hőmérsékleten, 1 atm nyomáson, 306 ford./pere keverés és 185 mmol 02/liter/ óra levegőztetés mellett 20 órán át fermentáljuk. A fermentléből kiszűrt micéliumglükózoxidáz összaktivitása literenként 2022 SE. Az 1. példához viszonyítva a jobb oxigéneliátottság az anyagcserét és az enzimszintézist élénkítette. A fermentációs idő 4 órával csökkent és a glükózoxidázhozam csaknem megduplázódott. Az öszszegyűjtött fermentléből a micélium egy mért aktivitású részét (985 000 SE) az 1. példa szerint előkészítve gyöngymalomban 10 liter/óra sebességi fokozaton feltárjuk. A sejtmaradványok elválasztása után az extraháló-lében található glükózoxidáz összaktivitás 970 000 SE (a micé-5 Mumra 98,5%). Az enzimet az extrahálő-léből kétszeres térfogatú izopropilalkohollal kicsapjuk, és szárítjuk. A poralakú preparátum összaktivitása 910 000 SE (a miceliumra 92,3%). 10 A fenti poralakú preparátum egy mért aktivitású részéből vizes oldatot készítünk és DEAE-cellulóz oszlopra felvisszük. A felvitt oldat aktivitása: 15 glükózoxidáz 2240 SE kataláz 282 BE amiláz 196 E Az eluálást az 1. példa szerint végezve a frak-20 dókból kapott enzimaktivitások: glükózoxidáz 1754 SE (78%) kataláz 228 BE (81%) amiláz 129 E (66%) 25 A katalázt az 1. példa szerint elkülönítve a frakcióban 166 BE katalázt (73%) és 94 E amilázt (73%) 30 kapunk vissza. 3. példa: Az 1. példa szerinti természetes táptalajt az 1. 35 példában leírt inokulummal oltunk be. A tenyésztést 500 literes fermentorban, 28 C° hőmérsékleten, 2 atm nyomáson, 306 ford./perc keverés és 185 mmól 02

/liter/óra levegőztetés mellett 16 órán át végezzük. A fermentléből kiszűrt 40 micélium glükózoxidáz összaktivitása literenként 2280 SE. A nyomás növelésével a fermentációs időt 16 órára tudtuk csökkenteni, a glükózoxidáz-hozamot pedig további 12%-kal növelni. 45 A fermentorokból kiszűrt micélium egy mért aktivitású részét (1 140 000 SE) az 1. példa szerint feltárjuk. A feltárt micéliumszuszpenzióból a sejtfal-maradványokat eltávolítjuk. Az extra-50 háló-lében található glükózoxidáz összaktivitás: 1 116 000 SE (a miceliumra 98%). Az extrahálólét tisztára szűrjük és az enzimet liofilizáljuk. Az extraháló-lében levő enzimaktivitást csaknem veszteség nélkül visszakapjuk: a prepará-55 tum összaktivitása 1 107 072 SE (a miceliumra 97%). Szabadalmi igénypontok: 60 1. Eljárás glükózoxidáz fermentációs úton történő előállítására és tisztítására, továbbá kataláz előállítására, azzal jellemezve, hogy természetes vagy félszintetikus táptalajt az Aspergillus niger törzs 1026/10/C2 UV variáns (deponálási szám: R5 45/1968. IV. 3.) 24 órás vegetatív tenyészetének 4