157650. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikus anyag, valamint ez anyag származékainak előállítására
11 157650 12 nátrium- vagy káliumfoszfát adalék bizonyult szükségesnek. Glükózt, . élesztőt vagy ammóniumsókat tartalmazó közegekben sokkal több ásványi-só adalékra, így pl. kálium-, magnézium-, vas-, cink-, mangán- és rézsókra van szükség.' A fermentációt Erlenmeyer-lombiikokiban, vagy különböző kapacitású laboratóriumi vagy ipari fermentorokban hajthatjuk végre. A fermentlé Adriamycin-tartalmát a következőképpen határozzuk meg: A fermemtlét 2 %-os Hyiflo Supracel^ (védjegy) segítségével szűrjük. A szűrt lé pH-ját 1 n iNaOH oldattal 8,6-ra állítjuk, magd 9 : il arányú kloroform : metanol eleggyel 'kétszer extraháljuk. Az extiraktokat vízzel mossuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot metanolban felvesszük, majd 1/15 mólos foszfátpuififerrel pH=5,4-re beállított Whatman M. M. Nr. 3. papíron kromatograif áljuk. Eluálószerként 7 : : 1 : 2 arányú propanol : etilacetát : víz elegyet .alkalmazunk. Az R/ érték alapján az: Adriamycinnek megfelelő vörös színű részt 9 : 1 arányú metanol : víz eleggyel eluáljuk, és a szűrt fermentlében levő Adriaimycm mennyiségiét spektrofotometriikus úton meghatározzuk. A mérést 4915 m/x hullámhosszon végezzük, és az eluálószer mintáját ismert ifaktorú Adriamycin-oldattal hasonlítjuk össze. A micéliumban levő Adriarnycin mennyiségét a következőképpen határozzuk meg: A micéliumot 4 : 1 arányú aceton : 0,1 n kénsav eleggyel extraháljuk, az extraktumot semlegesítjük és csökkentett nyomáson az eredeti térfogat 1/5-ére betöményítjük. A koncentrátumot 1 n NaOH oldattal pH = 8,6-ra lúgosítjuk, majd 9 :1 arányú kloroform : metanol eleggyel kétszer extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk, majd vákuumlban szárazra pároljuk. A maradék mintájának Adriamycintartalmát a fent ismertetlett módon határozzuk meg. Az Adriarnycin elválasztása céljaiból az antibiotikumot vagy magából a IfermentMből a rnieéhumtömeg szűrése nélkül, vagy az előzőleg szűréssel elkülönített mioéliumlból és a fermentléből külön-külön megfelelő oldószerrel kivonatoljuk. Ha az extrakciót elkülönítve hajtjuk végre, előnyösen a következő módom járunk el. A -fermentáció végén a fermentlét kovasavas adszorbenssel, mint [pl. Supercel^-rel elegyítjük, az elegyet szűrjük, és mind a szűrőlepényt, mind a szűrletet külön kezeljük. Az antibiotikum legnagyobb része a mioéliumból és kovasavas adszorbensből álló szűrőlepényben található. A szűrőlepényt elfcásásítj'uk, és szerves oldószerrel, pl. alkohollal mint metanollal, etanollal vagy butanollal, ketonnal mint acetonnal vagy metiletilketonnal, halogénezett szénhidrogénekkel mint kloroformmal vagy metiléndikloriddal, vagy szerves vagy szervetlen savak, pl. ecetsav, sósav, kénsav oldatával keverjük. Legcélszerűbben szerves oldószerek, mint alkoholok, vagy vízzel elegyedő ketonok 5 és szervetlen savak vizes oldatainak elegyét alkalmazzuk. Általában 7:1—3:il előnyösen 4:1 arányú aceton :0,1 n kénsav elegyet használunk fel. 10 A korábbiakban 8,5—9^0 pH-ériékre lugósított szűrt fermentléből az antibiotikum alko-, ' hol-, keton- vagy halogénezett rövidszénláncú alifás szénhidrogén-típusú vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel, mint amilalkohollal, fou-15 tilalfcohollal, meitilizobutilketonnal, metilénkloriddal, klorotformmal vagy ezek elegyével extrahálíva vonható ki. A szűrt fermentlé kiyonatolásának másik 20 módja szerint a fermentlevet savanyú formájú, katiioneserélő karboxil-gyan'tából (Amberlite IR 50fi típus) készített kromatográfiás oszlopon vezetjük át, amelyből a termék vizes-metanolos nátriumklorid oldat eluálószerrel szabadít-25 ható fel. A fermentlé és mioélium szerves kivonatait egyesítjük, semlegesítjük, vízzel elegyítjük, •miagd csökkentett nyomáson betöményítjük. A vizeis koncentrátum pH-ját 1 n sósavöldattal 30 3-ra állítjuk, majd az elegyet kloroformmal extriaháljuk. A különféle szennyezéseket tartalmazó extraktumot eltávolítjuk, a vizes réteget 8,5—9,0-as pH-értékre lúgosítjuk, és 9:1 arányú kloroform :metanol eleggyel extraháljuk. 35 Az extraktumot vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd csükikeníett nyomáson kis térfogatra bepároljuk. A koncentrátumiból etiléter hozzáadására főtöme-40 gélben Adriamyeint tartalmazó nyerstermék válik ki. Az Adriarnycin a szabad bázis formájában van jelen. Az Adrialmycint a különféle víz- és zsíroldható pigmeintszennyeaésektől ellenáramú megosztással vagy oszlopfcromaitográ-45 fiával választhatjuk el. Az előbbi esetben 2:2:1 arányú kloroform :metanol:5,4-es pH-jú 1/15 mólos foszfát puffer elegyet alkalmazhatunk; joibfo eredményeket kapunk azonban, ha foszfátpufferrel 5,4-es pH-ra beállított cellulóz-osz-50 lopon kromatograifáljuk és eluálószerként 7:1:2 arányú propanol :etilacetát: víz elegyet használunk fel. Az Adriamycin-tarltalmú frakciókat összegyűjtjük, . vízzel elegyítjük, maijd betöményít-55 jük. A vizes koncentrátum pH-ját 1 n nátrium. karbonát oldattal 8,6j ra állítjuk, majd az elegyet kloroformmal extraháltjuk. A kloroformos oldatot vízmentes nátriumszulfát fölött szárít-60 juk és kis térfogatra betöményítjük. A maradékot vízmentes, sósavas metanollal elegyítve narancssárga tűk alakjában Adriaimycin4iidrokloridöt kapunk, mely vízmentes etainollhól yég, rehajtott átkristályosítás után 204—205 C°-on 65 bomlás köziben olvad. A termék optikailag ak-6
