157617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosav-arilamidáz kvantitatív kolorimetriás meghatározására

3 157617 4 határozásához fajlagosság és érzékenység szempontjából nem optimálisak [Rehfeld—Peters: Acta biol. med. germán. 19 809—818 (1967); Rehfeld—Peters: Acta biol. med. germán. 19 819— 830 (1967)]. Alanin-4-(fenilazo)-fenilalanin használata esetében pedig a mérés előtt centrifugálni kell [Barth, A.,—Hoffmann—Pilch: Acta biol. med. germán. 16 575—585 (1966)]. A találmány célja aminosav^arilamidáz meghatározására szolgáló módszer kidolgozása, amely kiváltképpen a máj, hasnyálmirigy, vese és bél megbetegedéseinél, mint fajlagos és igen érzékeny eljárás használható és mellett nagy pontossággal gyorsan és egyszerűen kivitelezhető. Azt találtuk, hogy az aminosavarilamidáz alaninvegyületeket, így alaninhidrazidot, alanin-/?-naftilamidot és alanin-p-nitroanilidet jobban és fajlagosabban képes hasítani mint a leucin-vegyületeket. A találmány szerinti eljárás alapján úgy járunk el, hogy az aminosavarilamidáz-tartalmú vizsgálati anyagot: a). DL-alaninhidraziddal elegyítjük és az enzim által hidrolízis útján lehasított hidrazint valamely aromás aldehiddel, előnyösen p-dimetilaminobenzaldehiddel reagáltatva sárga színezékké alakítjuk, vagy b) DL-alanin-/?-naftilamiddal elegyítjük és az enzim hatására felszabaduló, pí-naftilamint valamely aromás aldehiddel, előnyösen p-dimetilaminobenzaldehiddel reagáltatva sárga színezékké alakítjuk, vagy c) L-Alanin-p-nitroaniliddal elegyítjük és az enzim hatására felszabaduló p-nitroanilint kolorimetriásan közvetlenül mérjük. Az alaninvegyületek aminosavarilamidázzal történő hidrolízisét 6,5—7,5 pH-értéken inkubálva végezzük. Az első két módszernél a hidrazinnak ill. /3-naftilaminnak például p-dimetils.minobenzaldehiddel végzett kondenzálásával egyidejűen az oldat pH-értékiét savasra állítjuk be, így narancsvörös színű só keletkezik. Az oldat megsavanyításakor az enzimreakciót egyidejűleg megszakítjuk. A keletkező színezéknek az aminosav-arilamidáz mennyislégével arányos extinkcióját 455 ill. 450 nm-en mérjük. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy az aminosav-arilamidázt például a vérszérumban gyorsan és kvantitatív meghatározzuk. A találmány szerinti eljárás előnye az ismert eljárásokkal szemben az, hogy nagymértékben specifikus és igen érzékeny. Az alanin-4-(fenilazo)-fenilamid szubsztráttal történő meghatározással szemben a találmány szerinti eljárás a következő előnyökkel bír: Az alaninhidrazid lényegesen könnyebben szintetizálható és ezáltal gazdaságosabb, s a moláris extinkciós koefficiens kb 4—5-ször nagyobb. Az alanin-^-naftilamidra a fajlagosság nagyobb, ezf az enzim mintegy kétszer olyan jól hasítja. A moláris extinkciós koefficiens 5-ször nagyobb. Ez a szubsztrát -az aminosav-arilamidáz specifikus hisztokémiai kimutatására használható. Az alanin-p-nitroanilid meghatározásánál, bár 5 a moláris extinkciós koefficiens azonos nagyságrendű, a módszer mint kinetikai vizsgálat kivitelezhető. A találmány szerinti három módszer közül egyiknél sincs fehérjekicsapódás, s így a mérés ÍQ előtti centrifugálásra nincs szükség. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 15 1. példa A szubsztrát alaninhidrazid 0,6 ml szubsztrát-puffer-oldatot (5 rész 7,15 2o pH-értékű, 0,6 mólos trietanolamin puffer és 1 rész 224 milimólos vizes DL-alanin-hidrazid-oldat) 25 C°-ra temperálunk és 0,1 ml szérummal vagy enzimoldattal 1 percig inkubáljuk. 5 ml színképző reagenst (1 rész 4 g p-dimetilamino„_ benzaldehid 100 ml 96%-os etanolos vagy metanolos oMata és 17 rész 0,1 N sósav) hozzáadunk és az anyag színét 30 perc múlva a színképző reagenshez viszonyítva 455-nm-en mérjük. Vakpróbát is készítünk, amelyben az enzimoldatot a reagens bevitele után adjuk az oldathoz. Az enzimaktivitást az anyag és a vakpróba extinkciójának különbségéből számítjuk ki. .2. példa: A szubsztrát alanin-^-naftilamid 1 ml szubsztrát-puffer-oldatot (0,75 mmől-os DL-alanin-/?-naftilamid-oldat 0,05 mólos 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldatban) 25 C°-ra temperálunk és 0,02 ml szérummal vagy enzimoldattal 30 percig inkubáljuk. Ezt követően 2 ml 0,4 N sósavat és 2 ml 4°/o-os p-dimetilaminobenzaldehid-oldaitat adunk hozzá. 10 perc múlva a képződött színt 450 nm-en, hasonlóan készített vakpróbával mérjük. A vakpróbához az enzimoldatot csak a sósav bevitele után adjuk hozzá. Az enzimaktivitást az anyag és a vakpróba extinkciójának különbségéből számítjuk ki. 3. példa: 55 A szubsztrát alanin-p-nitroanilid 2 ml szubsztrát-puffer oldatot (1 mmólos alanin-p-nitroanilid-oldat 0,05 mólos 7,0 pH-értékű foszfátpuffer-oldatban) 25 C°-ra temperálunk, 60 0,1 ml szérummal vagy enzimoldattal elegyítjük, az extinkciót 405 nm-en vízhez viszonyítva mérjük és 15 percig inkubáljuk. Ezt követően az extinkciót 405 nm-en vízhez viszonyítva ismételten mérjük. Az enzimaktivitást a két mérésnél 65 kapott extinkciókülönbségből számítjuk ki. 2