157512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kvintomicin komplex antibiotikum és összetevői előállítására
' 157512 23 24 tával kevertük, amikor is a hatékony összetevőik teljesen adszorbeálódtak a gyantán. A gyantát toronyiba öntöttük, és alaposan kimostuk vízzel. A kvintomicint 0,5 n sósavval eluáltuk. A hatékony összetevőket összegyűjtöttük, és 10 n nátronlúggal 7,6—7,8 pH-ra állítottuk be. Ezután tisztítás céljából 10 g alktívszenet tartalmazó oszlopon adszorbeálltattunfc. 0,01 %-os ammonias vízzel, majd vízzel mostunk, és 1:1 arányú 0,02 n sósav-metanol eleggyel eluáltunlk. A metanolt csökkentett nyomás alatt elűztük. Liofilizálással fcvintomicin-A-, kvintomicin-B-, kvintomicin-jC- és kvintomicin-D-komplex hidrokloridot kapunk 1 g mennyiségben. 2. példa: Az 1. példa szerint kapott 10 liter fermentlé pH-ját beállítottuk 7,0 értékre, majd két ízben 10 liter 5% laurinsavat tartalmazó izobutanollal extraháltuk. A két fázist szétválasztottuk, és a felső, izobutanolos fázist 2 pH-s híg sósavban oldottuk, majd az oldatot nátronlúggal közömbösítettük, csökkentett nyomás alatt bepároltuk, és liofilizáltuk. 200 g nyers por alakú kvintomicin-komplexet kaptunk. 3. példa: Az 1. példában leírttal azonos módon kapott f ermentlevat átbocsátottuk egy Amberlite IRC— 50 (NH4 fázis) ioncserélő gyantával töltött oszlopon, ahol a hatékony összetevők teljesen adszorbeálódtak a gyantán. A gyantát alaposan kimostuk vízzel, és a hatékony összetevők elválasztáséra 1,0 n vizes ammóniával eluáltuk. Az oldatokat összegyűjtöttük, és 2 n sósavval 6—7,8 pH-ra állítottuk be. A tisztítást ugyanúgy végeztük, mint az 1. példában. 4. példa: Streptomyces lividust tenyésztettünk sterilizált és 6,8 pH-ra beállított, 0,5% keményítőt, 0,05% glükózt, 2,0% szójabablisztet, 0,2% peptont, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot és 0,3% nátriumikloridot tartalmazó táptalajon. 35 C°-on kb. 50 óra alatt előtenyészetét készítettünk, majd ebből a fermentléből 300—400 ml-t hozzáadtunk 10 liter azonos összetételű .táptalajhoz, és 35 C°-on percenként 200 fordulattal való keverés közben, percenként 14 liter steril levegőt bevezetve fermentáltunk. 96 óra elmúltával a fermentlé pH-ja 7,8—8,2 volt, és a kvintomicintermelés maximumot ért él. A fermentlevet 10 percig 100 ml Amberlite IRC—84 (NH,; fázis) gyengén savas ioncserélő gyantával kevertük, amikor is a hatékony összetevők teljesen adszorbeálódtak a gyantán. A micéliumnak és a kimerült lének frakcionált szűréssel való eltávolítása után a hatóanyagokat tartalmazó gyantát oszlopba gyűjtöttük, vízzel alaposan kimostuk, és 2,0 n vizes .ammóniával eluáltuk. A hatóanyagokat összegyűjtöttük, és koncentráltuk, majd 30x2400 mm méretű, gyengén savas kationos ioncserélő gyantával töltött oszlopban adszorbeáltattuk. A pigmentes részleget 0,08 n ammonias vízzel dluáltuk, majd 0,1 n ammonias vízzel eluálvía előbb kvintomicin-A-t, majd ennek eluálása után kvintomicin-B-t, ennek eluálása után pedig 0,15 n ammóniás vízzel kvintomicin-C-t eluálltunk az oszlopról. Végül 0,3 n ammóniás vízzel a kvintomicin-D eluálódott. Koncentrálás és liofilizálás után tiszta kvintomicin-A-t, ikvintomicin-B, kvintomicin-C-t és kvintomicin-D^ kaptunk szabad bázis alakjában 650 mg, 4200 mg, 40 mg, illetve 120 mg mennyiségben. 5. példa: Az 1. vagy 2. példa szerint kapott 150 mg kvintomicinkomplexet feloldottunk kb. 40 ml desztillált vízben, és az oldatot 1 cm átmérőjű oszlopban, 30 ml Sephadex C—25 (NH4 fázis) gyantával adszoíbeáltattulk, majd a gyantát vízzel mostuk. 200 ml 0,05 n ammóniás vízzel és 200 ml 1,0 n ammóniás vízzel gradiens-módszerrel óránként 25 ml ütemben eluáltuk. Az eluátumot 4 ml-es részletékiben fogtuk fel. A kvintomicin-A a 45—50. részleteikben, a kvintomicin-B és az 53—58. részletékben és a kvintomicin-C a 88—90. részletekben eluálódott. Az eluálást 1,0 n vagy töményebb ammóniás vízzel folytatva megkaptuk a kvintomicin-D-t. Liofilizálás után a kvintomicin-A-t, kvintomicin-B-t, kvintomicin-C-t és kvintomicin-D-t szabad bázisként kaptuk 31 mg, 45 mg, nyomnyi, illetve 18 mg mennyiségben. 6. példa: Az 1. vagy 2. példa szerint kapott 150 mg kvintomicin komplexét feloldottunk 40 ml desztillált vízben, és az oldatot 1 cm átmérőjű, 30 ml karboximetíl-Sepbadex C—25-tel (NH4 fázis) töltött oszlopon (ammóniumformiátttal pufferolva) adszorbeáltattuk, majd az oszlopot vízzel mostuk. Az eluálást 200 ml 0,5 mólos ammóniumformiát oldattal és 200 ml 3,0 mólos ammóniumformiát oldattal végeztük gradiens-módszerrel óránként 25 mii ütemben. Az eluátumot 3 ml-es részletekben fogtuk fel. A kvintomicin-A a 29—37., a kvintomicin-B a 40—45. és a kvintomicin-C a 78—80. részletekben eluálódott. Az eluálást 3,0 mólos amrnóniumformiátoldattal folytatva megkaptuk a kvintomicin-D-t. Liofilizálás után tiszta kvintomicin-A-t, kvintomicin-B^t, kvintomicin-C-t és kvintomicin-D-t kaptunk szabad bázis alakjában 35 mg, 56 mg, nyomnyi és 19 mg rnenyny is égben. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
