157511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai előállítására
5 157511 6 Minthogy megfelelő mikroorganizmusok szükségszerűen előállítanák olyan enzimeiket, amelyek képesek arra, hogy megtámadják a fenti, 17-es helyzetben legalább 8-szénatomos alifás csoporttal rendelkező szteroid szübsztrátum gyűrűrendszerét, általános módszerek szerint alkalmas mikroorganizmusokat találhatunk, ha ezeket az alkalmas organizmusokat természetes forrásokból, így talajból, trágyából, felületi vizekből stb. kinyerjük. Erre a célra kizárólagos szénforrásként koleszterolt, valamint sókat tartalmazó táptalajt használunk. A táptalajt kertifölddel, trágyával stb. indkuláljuk és ezt követően megfelelő hőmérsékleten, pl. 10 C° és 40 C° között inkubáljuk, bár a magasabb vagy alacsonyabb hőmérsékleteik sincsenek kizárva. A kultúrát rázhatjuk vibrációs vagy rotációs rázógépen, de nyugvó kultúrákat is alkalmazhatunk a kívánt mikroorganizmusok koncentrálására. Eljárhatunk úgy is, hogy a közeget félig szilárd formában (agar-agar) alkalmazzuk és" a kívánt -mikroorganizmust Petri-csészéfeben szaporítjuk. Előnyös lehet, ha a talajt alkalmazása előtt , néhány hónappal vagy héttel koleszterollal vagy szénhidrogén-eleggyel összekeverjük, így Nocardia törzset (CBS Nr. 226 67) nyertünk ki olyan talajból, amelyet fáradt kenőolajjal kevertünk össze. A koncentrálás számára alkalmas közeg például az alábbi összetételű lehet: ammóniumnitrát 1 g/l Na2 HP0 4 1 g/l koleszterol 1 g/l csapvíz Az így koncentrált mikroorganizmusok megfelelő táptalajon tenyésztve képesek arra, hogy lebontsák az említett szteroid szubsztrátumokat, így a koleszterolt vagy a yS-szitoszterolt. Ha ez a lebontás az említett szervetlen inhibitorok valamelyikének jelenlétében megy végbe, 19 szénatomot tartalmazó szteroid képződik a kultúrában. Ez a szteroid a legtöbb esetben 3,17-dioxo-l,4^androszitadién, bár többek között 3,17-dioxo-4^androsztén is képződik kis menynyiségben. Azt tapasztaltuk, hogy ezen az úton sok megfelelő mikroorganizmus törzs izolálható. Ezek közül megemlíthetjük az alábbiakat: Arthrobaeter species, (CBS Nr. 220,67), Arthrobaeter species, (CBS Nr. 222 67), Arthrobaeter species, (CBS Nr. 223,67), Nocardia species. (CBS Nr. 226,67). A CBS számok a hollandiai Baamban a Centraal Bureau voor Schimmelcultures-nél deponált mikroorganizmuskultúrák bejegyzett számai. Nagyon előnyös, hogy a kívánt törzseket nem szükséges ezen az úton koncentrálni és izolálni. Az is lehetséges, hogy a mifcroor.ganizmusolkat talajból vagy egyéb megfelelő anyagokból izoláljuk és azután határozzuk meg, ha a kívánt tulajdonságokat mutatják. így talajok vizes szuszpenzióit megfelelő táptalajra, így keményítő-agárra vagy aszparagin-agarira kikenjük. A gombák normális növekedésének elnyomása céljából fungicid antibiotikumot adunk hozzá, pl. ml-ként 15 /ig primaricint. A talaj-szuszpenzió megfelelő hígítása útján elkülönült mikroorganizmus csoportakat izolálhatunk. Ezek a mikroorganizmusok azután megfelelő táptalajon tenyészthetők és meghatározhatjuk a kultúrák 17-es helyzetben legalább 8-szénatomos telített vagy telítetlen alifás gyökkel rendelkező szteroidot bontó képességét. Ha a lebontást a találmány értelmében inhibitor jelenlétében valósítjuk meg, a szteroid gsrűrűrendszerének lebontását elnyomjuk, és 19-szénatomos szteroidot kapunk, pl. 3,17-dioxo-l,4--androsztadiént. Ezen a módon több Nocardia speciest izoláltunk, amelyek koleszterol lebontására képesek és ezért a fenti szervetlen inhibitorok beadagolása után a kívánt 19-szénatomos szteroid képződött. A találmány szerinti eljárás céljára különösen előnyösnek bizonyultak a Nocardia species CBS Nr. 224.67 és CBS Nr. 225.67. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: Nocardia sp. (CBS Nr. 225.67) inokulációs kultúrát készítettünk oly módon, hogy a mikroorganizmus kultúráját pepton-glükóz-agar-ra inokuláltuk, 3 napon át 30 C°-on inkubáltuk, olyan táptalajon, amely 1 liter 6,8 pH-jú, előzőleg 30 percen át 110 C°-on sterilizált csapvízben 10 g élesztőkivonat (DIFCO) oldatából állt. A táptalajt 500 ml-es lombikokban tartottuk, mindegyik lombik 100 ml táptalajt tartalmazott. A kultúrát 48 órán át 30 C°-on ráztuk rotációs típusú rázóberendezésben (fordulatszám 250/perc és löket 2,5 cm), miután a mikroorganizmus eléggé kifejlődött a további inokulációhoz. A főfermentációs táptalajt úgy készítjük, hogy minden esetben 3 g (száraz anyagra szá^ mított) kukoricaáztatólevet csapvízzel 1 literre hígítunk, a folyadékban 3 g glükózt feloldunk, végül a.táptalaj pH-ját 7,0-ra állítjuk be vizes nátriumhidr'oxid-oldattal. Ezt a közeget 12 lombikban 30 percen át sterilizáljuk 110 C°-on. Mindegyik 2-literes lombik 1 liter közeget tartalmaz. A lombikokat a fenti inokulációs kultúrával inokuláljuk, minden lombikhoz 50 ml-t adva. Az inokulációs százalék ezért 5%: A lombikokat a fentiekben ismertetett módon 24 órán át 30 C°-on rázzuk. A szubsztrátumot, koleszterolt mozsárban 0,1 % Tween-80-at tartalmazó víz hozzáadása közben elporítjuk. Ezt a szuszpenziót a fenti kultúrákhoz adjuk olyan mennyiségben, hogy minden lombik 1 g koleszterolt tartalmazzon. 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 3
