157511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai előállítására
7 157511 Ezzel egyidejűleg 500 mg Co02 -H 2 0 vízzel készített steril oldatát adagoljuk mindegyik lombikba, ami kb. 125 mg kobalt-ionnak felel meg literenkint. Ezután a lombikokat azonos körülmények között tovább rázzuk. Már a kolesaterol beadagolása után 12—24 órával kimutatható vékonyrétegkromatográfiás úton a 3,17--dioxo-l,4-androsZtadién és a 3,17-dioxo-.4--androsztén jelenléte. Erre a célra a kultúra néhány miiiliterét egyenlő térfogatú etilacetáttal extiraháljuk és az extraktumot Stahl-féle szilikagél G-t alkalmazva fcromatografáljuk. Kieselgel F254 (Merck A. G.) kész lemezeket is alkalmazhatunk. Az eluálószer kloroform és etilacetát 100 : 6 térfogat arányú elegye. Az oszlopot benzol ós aceton 10 : 1 arányú . elegyével eluáljuk, és az androsztadiéndiont tartalmazó frakciókat vékonyrétegkromatográfia segítségével kimutatjuk, majd egyesítjük és bepároljuk. A maradékot (710 mg) aceton és heptán 1 : 3 arányú elegyéfoől áítfcristályosítjufc, így 640 mg tiszta terméket kapunk. Olvadáspont 139,5— 140,5 C°; a nagyon tiszta androsztadiéndiont minta 141—142 C°-on olvad. A két kristályos termék keveréke nem mutat olvadáspont-depreszsziót. A két minta infravörös spektruma azonos. A kristályos termék hozama koleszterolra számítva 12,9%. 2. példa: Az első példa szerinti módon Arithrobacter sp. (CBS Nr. 220.67) kultúráját állítjuk elő. A konverziót 3 500 ml-es, 100 ml táptalajt tartalmazó lombikban végezzük. Az kiokulációs kultúra mennyisége itt is 5% a fő fermentációs táptalaj térfogatára számítva. A lombikokat a szokásos módon 30 C°-on rázzuk, és az inokuláció után 24 órával mindegyik lombikhoz 200 mg kolesz'terolt és 50 mg NiSCv • 7íH2 0-t adunk, majd a lombikokat tovább rázzuk. 3—4 napi inkubáció után a lombikokban levő 3,17-dioxo~l,4~a:ndros2tadién teljes mennyisége 70,2—112 mg. A legtöbb esetben kis mennyiségű 3,17-dioxo-4-androsztén is képződik, azonban ennek a vegyületnek nagyobb része általában néhány napi rázás után eltűnik. iHozam a beadagolt koleszterolra számítva 16,0—25%. 3. példa: A második példa szerinti módon Arthrobacter sp. (CBiS Nr. 221.67) kultúráját alkalmazzuk. Minden lombikhoz 400 ml koleszterolt és 50 mg Co012 -6H 2 0-t adunk. Négy napon át 30 C°-on végzett rázás után minden lombikból 52 mg 3,17-dioxo-l,4-androsztadiént izolálhatunk az első példa szerinti módon. A képződött 3,17--dioxo-4-androsztén mennyisége elhanyagolható. A reagálatlan koleszterol mennyisége minden lombikban 290 mg. Eszerint 110 mg kdlesaterol alakult át minden lombikban, amelyből elméletileg legfeljebb 80 mg 3,17-dioxo-l,4-androsztadién képződhet. Így az a következtetés vonható le, hogy a hozam 65% az átalakult és 17,8% a beadagolt koleszterolra számítva. 4. példa: A 3. példa szerinti módon Arthroíbacter sp. törzset (CBS Nr. 222,67) használtunk. Az 1. példa szerinti módon végzett elkülönítéssel és tisztítással 29 mg 3,17-dioxo-l,4-androsztadiént kaptunk lombikonkinit, 4 napi rázás után. Hoaarn: 10% a beadagolt koleszterolra számítva. 5. példa: A 4. példa szerinti módon jártunk el Arthrobacter sp. törzset alkalmazva (CBS Nr. 222,67) azzal a különbséggel, hogy mindegyik lombikhoz 50 mg Ni,S04 • 7H2 CHt adtunk. 24 órával a koleszterol és az inhibitor beadagolása után az 1. példa szerinti módon vékonyrétegkromatográfiásan kimutatható a 3,17-dioxo-l,4-androsztadién és a 3,17-dioxo-4-androsztén jelenléte. 6. példa: A 4. példa szerinti eljárást alkalmaztuk azzal a különbséggel, hogy Arithrobacter sp. törzset (CBS Nr. 221,67), Arthrobacter sp. törzset (CBS Nr. 223,67), ill. Nooardia sp. törzsét (CBS Nr. 225,67) használtunk. Inhibitorként NiSCv - 7H20-t alkalmazva azt tapasztaltuk, hogy a 3,17-dioxo-l,4-androsztadién mennyisége az egyes lombikokban 24 mg és 38 mg között változott, így a kitermelés a beadagolt koleszterolra számítva 8,2% és 13,0% között van. 7. példa: Az 1. példa szerinti módon Nocardia sp. (CBS Nr. 224,67) inokulációs kultúrát készítettünk. A fő fermentációs táptalaj minden liter vízben, amelyhez 1 g élesztő kivonatot (DIFCO) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Három napi rázás után a 12 lombik tártai- -mát egyesítjük és az elegyét térfogatára számított 20%. metilizobutiliketonnal extraháljuk 3 alkalommal. Az extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, és a maradékot 80 ' ml forró metanollal extraháljuk. Ezzel a művelettel elkülönítjük a reagálatlan koleszteroilt a kívánt terméktől. A maradékból 5,2 g koleszterolt nyerhetünk ki. A metanolos extraktum tartalmazza az androsztadiéndiont. Az ' extraktumot s,7.kv&7.r& pároljuk, 30 ml benzollal felvesszük és 150 g alumíniumoxidot (A12 0 ; >: Woelm-féle, semleges, III-as aktivitás) tartalmazó oszlopon kromatográfiaijuk. 4
