157511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai előállítására
3 157511 4 reit is, pl. a koleszterilbetainátkloridot, koleszterilacetátot, koleszterilhemiszukcinátot vagy szubsztituált szterolokat, így az 5 ctHklórkolesztanolt vagy olyan szterolokat, amelyékben az A-gyűrű egy vagy több további szubsztituenssel rendelkezik. A reakcióközegben jelenlevő inhibitor miatt a szteroid alapszerkezete változatlan marad és csak a 17-es helyzetben levő alifás oldalláncon játszódik le reakció. Különösen alkalmasak erre a célra a szervetlen ionok, így a nikkel-, kobalt-, kadmium- és szelenitionok. Közelebbről a találmány tárgya eljárás a dimetil-ciklopentanoperhidrofenantrén alapszerkezetű szteroidok, különösen az 1,4-androsztadién-3,17-dion és a 4-androsztén-3,17-dion mikrobiológiai előállítására. A 17-es helyzetben levő ketocsoport könnyen kimutatható a Zimmerman-riekació segítségével, ha a 16-os helyzetben levő szénatom nem rendelkezik szubsztituensekkel [Id. W. Zimmerman, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 233 (1935) 257]. Az androsztadiéndion értékes termék, mert kiindulási anyagként szolgálhat androgen, ösztrogén, anabolikus és fogamzásgátló hatású vegyületek előállításaikor. Az új eljárás többek között lehetővé teszi, hogy a természetben előforduló koleszterolt átalakítsuk, amely önmagában csak korlátozott mértékben kerül felhasználásra, értékes közbenső-termékké. A találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint a mikroorganizmusokat szervetlen vagy szerves nitrogénforrást, így aminosavakat, ammónium-sokat, alkáli- és alkáliföldfémek nitrátjait, peptont tartalmazó közegben tenyésztjük. Kukorica-áztatólé, élesztő-kivonat, gyapotmag őrlemény, szójabab őrlemény, és hasonlók szintén nagyon alkalmasak. A közeg tartalmazhat asszimilálható szénforrásokat, így cukrokat, keményítőt, többértékű alkoholokat, bár a legtöbb esetben szerves nitrogénforrás jelenléte kielégítő. Továbbá az alkalmas közeg a szokásos mennyiségű sokat, így alkáli- és alikáliföldfémek foszfátjait, szulfátjait, kloridjait is tartalmazza. Nyomelemek általában kielégítő mennyiségben vannak jelen a csapvíz alkalmazásának következtében. Ha bonyolult összetételű természetes nitrogénforrásokat, így kükoricaáztatólét alkalmazunk, ásványi sok adagolását gyakran elhagyhatjuk. A közeget a szokásos módon sterilizáljuk, és ezután a kezelés után pH-ja 4,0 és 8,5 között van, általában a pH-érték 7,0 körüli. Amikor a sejtek állandó levegőztetés közben a közegben kielégítően elszaporodtak, hozzáadhatjuk a szteroidot, pl. a koleszterolt vagy '/?-szitoszterolrt megfelelő oldószerben, így N,N-dimetilformamidban oldva, vagy vízzel készített finom szuszpenzió alakjában. Az inhibitor beadagolandó mennyisége a körülményektől függ. Ha a koncentráció túl alacsony, a beadagolt szteroid teljesen lebomlik kis molekulasúlyú anyagokra. Ha a koncentráció túl nagy, nagyon inhibitálja szteroid konverzióját és néha még a mikroorganizmus is elpusztul. Ha NiS04 -7H 2 0-t alkalmazunk, literenkint 10—1000 mg mennyiség kielégítő, bár elképzelhetők olyan körülmények is, amikor alacsonyabb vagy magasabb koncentráció kívánatos. Ha kobaltkloridot, kadmiumszulfátot vagy nátriumszelenitet alkalmazunk, a koncentráció előnyösen szintén a fent megadott tartományba esik. A szteroid hozzáadásának időpontja 0 és 72 óra közé esik az inokuláció után, bár jó eredményeket kapunk akkor •• is, ha az adagolást később végezzük. Előnyösen azonban úgy járunk el, hogy a szteroidot a kultúra inokulációja után 24—48 órával adagoljuk be, amikor a mikroorganizmusok már kielégítően kifejlődtek. Fennáll annak a lehetősége is, hogy az adagolást nagyon korán, pl. azonnal az inokuláció után végezzük. Az inhibitort általában a szteroiddal egyidejűleg adagoljuk be, mert a baktériumok nem pusztulnak el, ha az inhibitort megfelelő koncentrációban adagoljuk. Ez könnyen megállapítható, ha a kapott kultúrákat megfelölő táptalajra kenjük a szteroid és az inhibitor beadagolása után. A szteroid konverziója állandó levegőztetés közben megy végbe 20 C° és 45 C° közötti hőmérsékleten, bár az eljárást megvalósíthatjuk alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékleten is. A reakciót előnyösen 30 C°-on végezzük, bár nem' szükséges, hogy a hőmérséklet azonos legyen a kultúra növekedése és a lebontó művelet folyamán. A mikroorganizmus 24 órán át fejlődhet 26 C°-on, ezután a hőmérsékletet 30 C°-ra emelhetjük a szteroid és az inhibitor beadagolása után. A beadagolt szteroid konverziója 1—7 nap, azonban a kívánt végtermék mennyisége általában nem növekszik tovább 3 nap után. Fontos végtermék szterolok esetében, ha az A-gyűrűben nincs további szubsztitúció, az 1,4--androsztatién-3,17-dion kis mennyiségű 4--androsztén-3,17-dionnal együtt, a kitermelési arányok többek között a levegőztetéstől függnek. A leírt körülményeik hatására az 1,4--androsztadién-3,17-dion a kívánatos túlsúlyban keletkezik a 4-androsztén-3,17-dionnal szemben. A képződött szteroidokat a kultúráiból vízzel nem elegyedő folyadékkal, így metilizobutilketonnal, etilacetáttal, metilénkloriddal, kloroformmail végzett extrakció útján nyerhetjük ki. Ezeket az extraktumokat szárazra pároljuk és a maradékot szerves oldószerrel extraháljuk, hogy eltávolítsuk az átalakulatlan szubsztrátumot, így a koleszterolt vagy stigmaszterolt. A megmaradó szilárd anyagot ezután kromatográfiásan és átkristályosítással tovább tisztíthatjuk és elkülöníthetjük a komponenseket. .10 15 20 2b 30 ,':5 40 45 50 55 60 V
