157501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citotetrinek előállítására
157501 19 20 dal 7,0-ra állítjuk. A táptalaj sterilezését 121° C-on 1,3—1,4 atü nyomáson 1 órán át végezzük. A pH a sterilezés alatt nem változik. A káliumnitrát vizes oldatát hasonló körülmények között külön sterilezzük, majd hozzáadjuk az elkészített steril táptalajhoz. A steril táptalajt 28°C-ra hűtjük, majd beoltjuk az inokulum-kultúrával. A tenyésztést steril levegő átfúvatásával, állandó keverés közben, 28°C-on végezzük. A keverő fordulatszáma 250/perc, levegőztetés 1/1 v/v. A fermentáció ideje 80—120 óra között változik. 300 liter így kapott erjesztéses oldathoz (1520 E/ml), melynek pH-ja 7,6—7,7, állandó keverés közben annyi oxálsavat adunk, hogy az elegy pH-ja 4,0 legyen. A gyengén savas erjesztéses oldatot keretes szűrőprésen megszűrjük, majd a micéliumtömeget 25 liter csapvízzel átmossuk, és levegő átfúvatásával kiszárítjuk. 285 liter savas szűrlétet kapunk (755 E/ml). A szűrlet pH-ját állandó keverés közben 5n nátriumhidroxiddal haladéktalanul 7,5-re állítjuk, majd +5° C-ra lehűtjük. A szűrőprésről leszedett nedves micéliumtömeg súlya 47 kg. A micéliumtömeget 50—50 liter 90%-os vizes metanollal, 30 percen át tartó keverés mellett háromszor extraháljuk. Az egyesített metanolos kivonatok térfogata 142 liter, hatóanyagtartalma 1450 E/ml. A vizes, metanolos extraktum pH-j át szilárd nátriumhidrogénkarbonáttal 7,5-re állítjuk, majd vákuumban 40°C-on 40 literre pároljuk be. A bepárlási maradékot egyesítjük az erjesztéses oldat szűrletével. Így 325 liter 1200 E/ml-es oldatot kapunk. Ehhez az oldathoz 50 kg techn. nátriumkloridot adunk, pH-ját 5n nátriumhidr oxid-oldat segítségével 7,8-ra állítjuk be, majd a citotetrint 3X 100 liter etilacetáttal extraháljuk. Az extrakciós maradék 45 E/ml citotetrint tartalmaz. Az egyesített etilacetátos kivonatot (285 liter, 1180 E/ml) 0,2n vizes ecetsavoldattal pH 4,5-n extraháljuk (3X30 liter). így 82 liter 3750 E/ml vizes kivonatot kapunk. A vizes oldat pH-ját nátriumhidrogénkarbonáttal vagy nátriumhidroxiddal 7,5-re állítjuk be, majd az oldathoz 10 kg nátriumkloridot adunk és 3X20 liter etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített etilacetátos kivonat térfogata 58,5 liter, és 4850 E/ml citotetrint tartalmaz. Ezt az oldatot 3X8 liter 0,5n vizes ecetsavoldattal extraháljuk, majd a nyert 23,5 liter, 11200 E/ml hatékonyságú sötétvörös, vizes oldatban 5 kg nátriumkloridot oldunk és pH-ját 5n nátriumhidroxiddal, állandó keverés közben 7,5-re állítjuk be. A vizes oldatot ezután 3X5 liter kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos extraktumokat (15 liter, 15900 E/ml) szilárd nátriumszulfáttal megszárítjuk, majd vákuumban maximálisan 35°C-on szirupsűrűségig pároljuk be. A sötét, vörösbarna szirupos maradékhoz 5 liter petrolétert adunk, aminek hatására a citotetrin-komplexet narancsvörös színű, amorf porként kapjuk meg.' Súlya 125 g, biológiai hatékonysága 1650 E/mg. 2. példa 1 db 6 cm átmérőjű kromatografáló oszlopot 85 cm magasságig megtoltunk butanol :etilacetát 5 5:1 arányú elegyével telített, 4,25 pH-jú, 0,1 mólos citrátpufferban felszuszpendált Celit 535-tel. Az oszlopot 2 liter puff er oldattal, majd 3 liter, a fenti pufferral telített butanol : etilacetát 5 :1 arányú elegyével átmossuk. 10 g, az 1. példa szerint kapott citotetrin-komplexet feloldunk 100 ml fenti butanol-etilacetát elegyben, majd ezt az oldatot visszük a kromatografáló oszlopra. A kromatográfiai 4,25-ös 0,1 mólos citrátpufferral telített n butanol :etilacetát 5:1 elegyével végezzük. A kifejlesztés sebessége 250 ml/óra. A kromiatografalás során 50—50 ml-es frakciókat szedünk. Az egyes frakciók hatóanyag-tartalmát biológiai értékméréssel és a 475 m/t-nál végzett extinkció-méréssel, az egyes komponensek minőségét pedig papír- és rétegkromatográfiás módszerrel vizsgáltuk. Az eredményekét az 5. táblázat szemlélteti. 5. táblázat Frakciók Komponensek 5-- 16 I. inaktív 17-- 22; I.+11. inaktív 23-- 40 II. inaktív 41-- 60 II. inaktív+citotetrin A 61--145 citotetrin A 146--206 citotetrin A=citotetrin B 207--230 citotetrin B+nyomnyi citotetrin A 231--239 citotetrin B+citotetrin C 240--258 citotetrin C+nyomnyi citotetrin B 259--270 citotetrin C+citotetrin D 271--306 citotetrin D 307--325 citotetrin D +citotetrin E 326--382 citotetrin E A 61—145, 207—230, 240—258, 271—306 és a 326—382 frakciókat egyesítettük (az egyesített frakciók biológiai aktivitása sorrendben: 2600, 1510, 1760, 186, 102 E/ml). Az egyetlen komponenst tartalmazó egyes frakciókhoz azonos térfogatú petroléter és 1/10 tf 0,5 n ecetsav oldatot adunk, majd az elkülönült alsó fázisokat pH= 7,6-ra történő semlegesítés után kloroformmal extraháljuk, és az extraktumoknak szirupsűrűségig történő bepárlása után petroléter segítségével kapjuk meg az egyes kromatográfiásan tiszta komponenseket. A kapott anyagokat minimális mennyiségű acetonban oldjuk, és az oldatot csontszenezéssel derítjük, n-Hexános lecsapással, kromatográfiásan tiszta citotetrin komponenseket kapunk. A nyert anyagok menynyisége a következő: citotetrin A 3,30 g citotetrin B 0,91 g citotetrin C 0,67 g citotetrin D 0,90 g citotetrin E 0,36 g 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
