157501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citotetrinek előállítására
157501 21 22 Á ki omatógráfiás oszlop eluálása után az oszlop középső részén maradt narancssárga színű sávot metanollal leoldjuk, majd az oldatot sómén tesítjük. és szárazra pároljuk. így 0,06 ciloteirin F-t kapunk, 5 3. példa n-Butanol és 0,1 mólos, pH 4,0-s citrát puffer 1:1 arányú elegyét egyensúlyba hozzuk, majd az elkülönített felső, butanolos fázis 500 ml-ében 10 g 1. példa szerint kapott citotetrin komplexet oldunk. Ezután a citotetrint a fenti rendszerben ellenáramú megosztásnak vetjük alá. A mozgó fázis a könnyebb butanolos, míg az álló fázis a nehezebb vizes oldat. A megosztást 10 rázótölcsérből álló sorozattal végezzük. Az alsó és felső fázis térfogata 500—500 ml. A 10. megosztás után az első két frakció alsó fázisait egyesítjük. Az egyesített, vizes fázisok pH-ját szilárd nátriumhidrogénkarbonáttal 7,5-re állítjuk •- be, majd 3X500 ml kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos extraktumokat szirupsűrűségig szárítjuk, majd petroléterrel lecsapjuk. 3,1 g, főképp citotetrin D-t, E-t és F-et tartalmazó anyagot kapunk, mely szennyezésként kevés citotetrin B-t és C-t is tartalmaz (I. keverék). A megosztásnál kapott 3—10. felső fázisokat egyesítjük, majd azonos térfogatú petroléterrel elegyítjük és 3X0,1 tf 0,2 n ecetsavval extraháljuk. Az egyesített vizes (kivonatok pH-ját 7,5-re állítjuk és 3X1/4 tf kloroformmal extraháljuk. Így 6,2 g citotetrin A-t, B-t, C-t és az I. és II. inaktív szennyezéseket tartalmazó elegyhez jutunk (II. keverék). 4. példa A 3. példa szerint kapott II. keverékkel az előzőekhez hasonló módon pH=5,0-ös citrátpuffer és n-butanol között 10 lépéses ellenáramú megosztást végzünk. Az álló vizes fázis térfogata 400 ml, míg a mozgó, butanolos fázis térfogata 600 ml. A 4—9. csövek alsó, és a 7—9. csövek felső fázisa tartalmazza az I. és II. inaktív anyagokat, míg az első oső alsó fázisa az A, B és C komponensek mellett még kis mennyiségű D és E komponenst is tartalmaz. Ezen csövek kivételével az összes többi fázist egyesítjük, és az elegyhez azonos térfogatú petrolétert, valamint 1/4 térfogat 0,ln ecetsavat adunk. Az elkülönített, savanyú vizes fázisból semlegesítés és kloroformos extrakció után 4,8 g citotetrin A, B-t és C-t tartalmazó elegyet kapunk (III. keverék). 5. példa A 4. példában kapott III. keveréket egy újabb 15-lépéses ellenáramú megosztással n butanol és 5,5 pH-jú 0,1%-os citratpuffer között, 300—300 ml-es fázistérfogatokkal tovább bonthatjuk. A 6—-14. csövekből (mind.az alsó, mind a felső fázisokból) minimális mennyiségű B és C komponenssel szennyezett citotetrin A nyerhető {2,25 g). Az 1—4. csövek alsó és felső fázisaiból pedig 1,93 g citotetrin B-ből és C-bő.1 álló. elegy állítható elő. Az első citotetrin A-dús frakcióból 5,9-es pH-jú 0,1,mólos citratpuffer és n butanol közötti újabb 10-lépéses megosztással (fázistérfogatok 200—200 ml) a 4—9. csövek tartalmából 1,42 g kromatográfiásan tiszta citotetrin A állítható elő. A fentiek szerint kapott citotetrin B és C elegyből 6,3 pH-jú 0,1 mólos citratpuffer és n butanol közötti 25-lépésss ellenáramú megosztással a 3—7. csövek tartalmából tiszta citotetrin C (0,48 g), a 12—17. csövekből pedig kromatográfiásan tiszta citotetrin B nyerhető (0,71 g). 6. példa A 3. példa szerint nyert I. keveréket ,(3,Q. g) p,H=7,3-as 1/15 mólos fpszfátpuffer és n butanol közötti 30-lépéses ellenáramú megosztással borítjuk fel összetevőire. A megosztásnál 400 ml-es alsó és 500 ml-es felső fázisokat alkalmazunk. ,A 9—17. csövek tartalmát egyesítjük. Ebből az oldatból 0,92 g kromatográfiásan tiszta citotetrin D, a 20—24. csövek egyesítése után nyert oldatból pedig 0,63 g kromatográfiásan tiszta citotetrin E állítható elő. 7. példa A Streptomyces griseoflavus „CBS—Cifferi" törzs burgonyafőzet-glükóz-agaron nőtt tenyészetét 10 ml deszt. vízzel lemossuk, majd leszűrjük, és üveggyönggyel 3 percig erőteljesen rázzuk. Az így nyert spóraszuszpenziót (csíraszáma r 2,108 /ml) 500 W teljesítményű, 254 nyt-os fényt adó ultraibolya lámpával 15 cm távolságból 2 percig besugározzuk, majd burgonyafőzet-glükóz agárra szélesztjük. 4 napos, 28 C°-os inkubáció után a 99'%-os pusztulást mutató lemezekről burgonyafőzet-glükóz-agarra 100 ferde tenyészetet oltunk, majd bespórázás után ezekről az 1. példában megadott módon rázott kultúrákat készítünk. Az így végzett tenyésztés után a legjobb termelőképességű tenyészeteket kiválasztva kapjuk a 37, 43, 69, 81 és 86 jelzésű variánsokat. A fenti Variánsok citotetrin-termelő képessége sorrendben a következő: 1450, 2100, 2400, 3200 és 1800 jug/nű. A nagyüzemi fermentáció céljaira a legmagasabb termelési képességet mutató 81 jelzésű variánst választottuk ki. Az egyes variánsok által termelt citotetrin komplexben a komponensek százalékos aránya kismértékben eltérő. Így pl. a 37. jelzésű variáns elsősorban a B, míg a 69. jelzésű elsősorban a C komponenseket termeli nagyobb mennyiségben. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 n
