157483. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urikáz előállítására
13 157483 (Táblázat folytatása) 14 Mi kroorganizmusok l'OOO 1 táptalajra vonatkoztatott mennyiség 1(g) Fusarium oxysporum 735 Stemphyliuim. macrosporoideum 700 Macrosporium apiospermum 653 Fusarium orthooeras 729 Absidia glauca+1801 Mucor mucedo 1202 Mucor hiemalis 1205 Mucor raoemosus 1209 Rhizopus arrhizus 1212 Basidiomycetae sp. 1500 Geotrichum candidum lactis 801 1,7 1,1 1,0 2,1 1,2 2,5 1,8 1,3 2,3 2,7 2,9 300.000 240,000 250.000 210.000 280.000 195.00 200.000 210.000 240.000 215.000 230.0ÖO *S.E.A.B. gyűjtemény száma 1. Alap A mikrobiológiai eredetű urikáz a húgysavnak allantoinná történő oxidációját oxigén jelenlétében, a csatolt I reakciőképlet szerint katalizálja: Az aktivitást úgy mérjük, hogy az alábbiakban ismertetett műveleti feltételek között meghatározzuk a íreakcióközegbe bevezetett húgysav félmennyiségének oxidálásához szükséges urikáz mennyiségét. A mennyiiségi meghatározást a húgysavat tartalmazó oldat optikai sűrűségének csökkenésére ailapítjuk az enzimes készítménnyel történt inkubálás után. A húgysavnak savas oldatban UV fényben 285 millimifcronnál van abszorpciós maximuma. Mivel az optikai sűrűség a mérés körülményei között arányos a húgysavkoncentrációval, ilyen módon mérhető az elbontott húgysav és ezt követően meghatározható az enzimaktivútás. Az urikázaktwitás egysége annak az enzimmennyiségnek felel, meg, mely a szubsztrátum, vagyis az eredetileg beadagolt húgysav félmenynyiségének elbontására képes a mérés körülményei között. 2. Reagensek a) No. 6671 tisztított húgysav „C fokozat", a California Biochemical Research készítménye. b) trisz-(hidroximc!t!il)-aminometán (rövidítve Tris) purisis ., Fluka féíe készítmény, c) Complexon III, dinátriumetilén-diaminotetraacetát só, analitikai készítmény) Prolabo gyártmány, hiv. szám: 20 302, d) analitikai sósav, Prolabo gyártmány, hiv. szám: 20 252 A. A reagenseik előállítása a) Tris törzsoldat+,5 Complexon III" 6,05 g Tris-t kb. 100 ml desztillált vízben, 25 ugyanakkor 373 mg „Complexon III"-t 50 ml vízben oldunk, a (két oldatot összekeverjük, majd feltöltjük 500 ml-re desztillált vízzel. 30 35 40 b) 0,05 M 8,5 pH-jú Tris puffer 250 ml (a) törzsoldiathoz kb. 15 ml desztillált vizet adunk és 0,2 ÍM sósavval a pH-t 8,5-re állítjuk be; ezt követően 500 ml űrtartalmú mérőlombikba öntjük át és desztillált vízzel 500 ml-re tälitjük fel. c) Húgysav törzsoldat 100 mg húgysavat 50 ml (a) törzsoldathoz adunik, 30 ml desztillált vizet adunk hozzá és a pH-t 8,5-Hre állítjuk be. Az anyagot 1100 ml űrtartalmú mórőlombikba öntjük és a mennyiséget desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki. Ezt az oldatot egy hétig hidegen konzerváljuk. 45 d) lOO^cg/ml szubsztrátoldat Az előző törzsoldatot 8,5 pH-jú puffemrel tízszeresre felhígítjuk (az oldat csak egy napig használható). 50 e) Enzim oldat A titert kb. 0,5 e/ml-re szabályozzuk. 55 B. Eljárási lépések 4 db egyenként 10 ml névleges térfogatú kémcsőbe az alábbi anyagokat öntjük: 60 65 1 sz. 2 sz. 3 sz. 4 sz. Tris puffer 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml enzim-oldat — — 2 ml 2 ml A kémcsöveket vízfürdőbe helyezzük és 5 perces elcinkubálás után 1 ml 100/u ucg/ml húgy, 7
