157483. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urikáz előállítására
157483 Az ily módon kapott csapadékot elválasztjuk például centrifugál ás segítségével. A benne levő szerves folyadékot melegítés nélkül vákuumban gyorsan eltávolíthatjuk. A terméket vízzel ismét felvehetjük Mofilizálás végatt, szűrés vagy centrifugáHás után és ily módon félig tisztított termékhez jutunk. Steril termék biztosítása érdekében az anyagot membránon szűrjük, vagy a liofilizálás előtt hővel sterilizáljuk. Lúg hozzáadásával történő kicsapás esetén a sókat vagy dialízis útján, vagy pedig molekuláris szűrőn, például dextrán vagy poliafcxilainid getan való gyoins átvezetéssel távolítjuk el. Lehetséges továbbá a k'ét műveletet kombinálni is, így példaképpen a puffer oldattal 8,5 pH-án felvett nyers aeétonos csapadékból származó vizes extiraktuimot lúg hozzáadásával kezelni. Szükségessé válhat továbbá a tisztítási művelet tovább fokozása is. Ez úgy történik, hogy szerves oldószerben vsuó kies-apást kombinálunk vizes ammóniumszulfátban történő kicsapással. Ugyancsák alkalmazható bentoniton vagy aluminiumoxidon való megkötés és perkolálás is, melyet sóoldatokkal való kilúgozás követ. A tisztítás végül még tovább fokozható úgy, hogy a már tisztított terméket egyszeri vagy többszörös kromaitografálásnak vetjük alá, amikor is olyan anyagból készített oszlopot használunk, mely a tisztátlanságck, főleg az extratotumokban még található proteinek kiválasztását lehetővé teszi. A fenti célra alkalmazható anyagok főleg, de nem kizárólagosan cellulóz-származékok, dextránok és poliakrilanaidok. Az éluálást a pH-érték vagy a molaritás folyamatos vagy fokozatos változásával lehet végrehajtani. 10 15 20 lógiai termékekre, amelyek vegyi összetétele közel áll a húgysayéfaoz. Ily módon megállapítható, hogy ez az enzim rendkívül specifikus. Oldatban az urikáz-^aktivitáist állati vérszérummal védjük. A továbbiakban isimertetett példák az új urikázt és előállítási eljárását ismertetik anélkül, hogy a találmány csak ezekre a példákra korlátozódnék. 1. példa: Törzs: Aspergillus flavus oryzae No. 624. Oltóanyag: spórás tenyészet, amelyet 9 napon át 28 C° hőmérsékleten két 1 'literes Roux-palackban rizsen tenyésztünk, majd literenként 6 g NaCl tartalmú 2 liter fiziológiás oldatban ismét felveszünk. A táptalaj: 25 .30 40 45 A találmány szerinti eljárással kapott urikáz amorf por, színtelen Vagy enyhén sárgás színű, vízben és szokásos -pufferekben oldható, oldhatósága sokkal jobb lugas, mint savas közegben. A szokásos oldószerekben, mint etanolban, metanolban, aoetonbam, éterben és kloroformban nem oldható. Az aktivitás optimális pH-ja 8,5, az aktivitás optimális hőmérséklete pedig 30 C°, az aktivitás még 37 C° hőmérsékleten is igen jelentős. Aktivitását részben gátolják a következő kationok: Zin++ , Cd ++ , Mn++, Fe +++ , Oo ++ , Ni++, A1+++ 10-''—10-5 M koncentrációban és Hg++ 10~6 M koncentrációban. Cu kismértékben 5C gátló ion (30%-os gátlóbatás 10—3 M koncentrációban). A kalcium, nátrium, kálium, magnézium és mangán csak igen kis mértékben vagy egyáltalában nem gátló hatású 10~J M koncentráció értékig. 55 60 A következő — borát, karbonát, acetát, citrát, nitrát, klorid és foszfát—anionok kis vagy közepes koncentrációban hatástalanok az urikázra; ugyanakkor a nitrát és klorid anionok 10— 1 M koncentrációban részben gátlók lehetnek. Az urikáz hatástalan koffeinre, teobrőminra, teofilinre, xantinra, 8-fclórxantinira, 2,8-ditio-6--hidroxipurinra stb., vagyis a legfontosabb bio- 65 Glukóz 40 kg Nátriumnitrit 3 kg Dikáliumhidrogéínfoszfát 0,750 kg Káliumfoszfát 0,250 kg Kalciumkarbonát 1 kg Magnéziumszulfát (7 H2 0) 0,500 kg Vasszulfát (7 H2 0) ' i g Kobaltszulfát (7 H2 0) 10 g Élesztő'kivonait 1 kg Kukoricalelkvár 0,300 kg Húgysav 0,600 kg Vízzel kiegészítve 1000 literre. A táptalaj pHna 6,45. A táptalajt 30 percig 120 C° hőmérsékleten sterilizáljuk. A beoltás lehűtés után a fentiekben ismertetett oltóanyaggal történik. -Tenyésztés: A tenyésiztés folyamán a táptalaj hőmérsékletét 28 + 1 C°on tartjuk, a táptalaj levegőztetését steril levegő segítségével végezzük, melyet a táptalaj literére és percenként számolva 0,3 liter mennyiségben az edény alján vezetünk be. 24 órás tenyésztés után, melyet a fentiekben ismertetett feltételek között X'égzünk, 150 e/g titerű 20 kg súlyú micéliumot kapunk. A micéliumot 40 liter desztillált steril vízzel mossuk, majd —20 C°-on gyorsan miegfagyasztjuk. Az enzim elkülönítése: á —20 C°-ra fagyasztott micéliumot porítjuk, majd 40 liter ammóniás vízben 9 pH-n újra falvesszük; csökkentett nyomáson térfogatániák egynegyedére történt besűrítés után és két térfogait acetonban való kicsapás után 7000 e/g titerű 300 g súlyú nyers terméket kapunk. Ezt az anyagot 0,0002 M nátriumkarbonát 3,8 liter vizes oldatával felvesszük. Centrifugálás után az oldatot azonos térfogatú am.mómumszulfát telített vizes oldatával kezeljük. A kapott csapadékot centrifugáljuk, majd 0,002 M nátriumkarbonát vizes oldatával ismét felvesszük. A megmaradó oldhatatlan részt centrifugálással eltávolítjuk. A fennmaradó részt 4
