157483. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urikáz előállítására
9 157483 10 0,0002 M nétriumkarbonéttal pufferolt „Sephadex G 25" oszlopon ásványi anyagoktól megtisztítjuk és az aktív eluátumokat Millipore GS membránon történő átvezetéssel sterilizáljuk, majd liofilizáljuk. Ilyen módon 49 000 e/g titerű 57 g súlyú termékeit kapunk. 2. példa Törzs: Aspergillus ifllaivus oryzíae No. 624. Az oltóanyagot úgy készítjük, hogy 2 liter Sabouraud-féle folyékony táptalajt Czapek Dox agar-kulltúrával oltunk be. 40 óra után ezt a tenyészetet alkalmazzuk ugyanazt a táptalajt .tartalmazó 100 liter fermentlé beoltására. A 28 C° hőmérsékleten végzett tenyésztésnél a 30. óra végén ezt a második oltóanyagot alkalmazzuk a tulajdonképpeni fermentálást szolgáló táptalaj beoltására. A táptalaj összetétele: Glukóz Szacharóz Nátriumnitrát Dikáliumoidrogénfoszfát Káliumf oszf át Kalcium-karbonát Magnéziumszulfát (7 H2O) Vasszulfát (7 H2 0) • Kukorica-lekvár Malátakivonat Kazein-MdroMzátum Rézszulfát Húgysav Vízzel kiegészítve 3000 literré. A táptalaj sterilizálása: 1 órán át mérsékleten. 100 kg 15 kg 6 kg 2,250 kg 0,750 kg 3,0 kg 1 kg 3 g 1 kg kg 0,300 kg 1 g 2 kg 1 120 C° hő-A beoltás lehűtés után a fentiékben ismertetett oltóanyaggal történik. Tenyésztés: a tenyésztés során a táptalajt 30 + 1 C° hőmérsékleten tartjuk és 150 ford./perc sebességű propelier-keve. ővel keverjük. A táptalajt steril, percenként a táptalaj literére számolva 0,2 liter levegő átvezetésével levegőztetjük. 31 órán át történő tenyésztés után a táptalajhoz 2 kg sterilizált nátóurnnitrátoít, 0,5 kg sterilizált húgysavat adunk, 43 órán át tartó tenyésztés után ilyen módon 60 kg 140 e/g titerű mticéliumot kapunk. A micéliumot desztillált steril vízzel mossuk, és ezután —20 C°-on gyorsan megfagyasztjuk. Az enzim elkülönítése: A fagyasztott micéliumot porrá törjük, majd 120 liter ammonias vízzel 5 pH-n extraháljuk. Szűrés után a pH-t ismét 9-re állítjuk be -és á térfogatot csökkentett nyomláson 40 literre sűrítjük 'be. A sűrítményt bázikus ólomacetát vizes oldatával (10 súly% ólomtartafam) derítjük. Centrifugálás után a fennmaradó részt, mely az ürifcázt tartalmazza, 48 liter amimóniumiszulfáttal telített vizes oldattal egészítjük ki. A centrifugálás segítségével kiválasztott csiapadékot 0,002 M nátriumfcarbonát 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 65 2,5 liter vizes oldatával újra felvesszük, majd „Sephadex G 25" oszlopon vezetjük keresztül. Az aktív eluátutmdkait liofilizáljuk és ilyen módon 91 000 e/g titerű 54 g terméket kapunk. 3. példa A 2. példában leírtakkal azonos módon járunk el és 87 000 e/g titerű 58 g terméket kapunk. Ezt iá terméket 0,01 M ammóniumkarbonátban feloldjuk és az oldatot 0,01 M ammóniumkar'bonát vizes oldatával 9 pH-ra pufferoit D.E.A.E. cellulóz-oszlopon vezetjük át. Az oszlopot ezután 0,05 M ammóniuimikarbonát oldattal mossuk. Az urikázt eluáljuk úgy, hogy a puffer modaritását növeljük. Folyékony anyagként 4,7 g 340 000 e/g titerű terméknek megfelelő anyagot kapunk. 4. példa A 3. példa szerinti eljárással kapott tisztított 4,7 g terméket a következő eljárással tisztítjuk tovább: A Kiromatografálásból, majd azt követően D.E. A.E. cellulóz-oszlopom végzett eluálásból származó legaktívabb frakciókat térfogatuk egyhatodára sűrítjük be csökkentett nyomáson 'és a sűrítményt „Sephadex G 100" oszlopon vezetjük keresztül. A legaktívabb eluátumok kiválasztásával folyékony állapotban 1,1 g 520 000 e/g titerű anyaggal egyenértékű terméket kapunk. A példákban ismertetett módon eljárva az alábbi táblázat első oszlopában felsorolt mikroorganizmusok alkalmazásával, a táblázat második oszlopában g/l-ben megadott végtermék-mennyiségeket kapjuk, 'míg a táblázat harmadik oszlopa a kapott végtermékek e/g-ban megadott tartalmát tűnteti fel. A 3. és 4. példában az aktivitást specifikusan fejeztük ki, mégpedig a teljes aktivitást viszonyítottuk az oldatban levő proteinek mennyiségéhez, melyet miifcrobiuret eljárással határoztunk meg. Az 1. és 2. példában ezzel szemben az aktivitás értéke száraz súlyra vonatkozik. A találmány szerinti eljárással előállított urikáz lehetővé teszi a húgysavnak és az uratoknak az 'állati szervezetiből való, gyors, specifikus és intenzív eltávolítását, azoknak vízben oldódó allantoin vegyületekké való átalakításával. A találmány szerinti urilkáz különösképpen laboratóriumi készítményként alkalmazható kutatási célokra és a íhúgysav koncentrációjának megállapítására. A továbbiakban az urátoxidáz vagy urikáz mennyiségi meghatározására irányuló eljárást ismertetjük. 5
