157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 17 If A peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére szolgáló, találmány szerinti TCA eljárás abban áll, hogy kiindulási anyagként egy aminavagyületet, így aminosavat, pepiidet vagy azok szabad amino-csoportot tartalmazó száinmiazéfcát egy N-tiokarboxi-aminosavanhidridldel vagy annak származékával reagáltatunk vizes közegben, olyan ellenőrzött .feltételek mellett, hogy a reakció lefolyása alatt számottevő koncentrációban reakcióképes alakban jelenlevő egyetlen amino-csoport az aminosav, peptid vagy ezek származékainak az az amino-csoportja legyen, amelynek a kívánt termék kialakítása céljaiból reagálnia kell, és még a iképződött pqptid-termékben se legyen egyéb amino-csoport- reakcióképes, alakiban. A találmány szerinti eljár ásnak megfelelően gondosan szafoályozaitt feltételek mellett a tioanhidrid, valaiminit az aminosav, peptid vagy ilyen származék közötti reakció a szintézis mindan egyes lépésiében csupán minimális mérteikben teszi lehetővé olyan melléktermékek képződését, amelyek zavarnák a következő tioanhidirid-reakciót/ vagy a kívánt termék tisztítását. A szabályozott feltételek mellett meggátoljuk, hogy á közbenső termékként képződő N-Jtiökarboxi-vegyület detiolkairboxilezcdjön, vagy — amennyiben bekövetkezik a détiokarboxileződés — a keletkező amino-csoport protonfelvétel folytán védve van mindaddig, amíg. lényegileg az összes kiindulási anyag le nem reagál a tioanhidiriddel. Ennek a gondos szabályozásnak az az eredménye, hogy leggyorsabban az a reakció megy Végbe, amely a kívánt terméket eredményezi, és a nam-kívánatos (melléktermékek, különösen a reakció túlfutásából és polimenizációból származó melléktermékek képződését olyan határok között tartjuk, amelyeik nem zavarják a szabályozott szintézis további lépéseit. Az N-itiokarboxi közbenső termék vagy a reaigálatlan tioanhidrid elbontását követően a képződött peptid-terméket tovább lehet reagáltatni hasonló körülményék között másik tioanhidriddel, közbenső termékek elkülönítése nélkül. A találmány széles köriben alkalmazható dipeptidak előállítására rendes körülmények között 95—98'% termelésekkel, sőt gyakran lényegileg kvantitatív kitermeléssel, valamiint előre meghatározott szerkezetű polipeptidek és proteinek előállítására. A TCA eljárás minden egyes reakciójában van egy optimális védő pH-érték. Az adott reakciótól függően ez a pH 4 és 10 közé eshet. Az olyan reakciók esetében, amelyekben a tiokarbamát a védő csoport, az optimális védő pH a lúgos oldalra esik, rendszerint 7,5 és 10 közé. Peptidreagensek esetében a védő pH lényegileg teljes reakció esetén alacsonyabb lehet, mint "az amiiinosav-ffeagensék esetében. Ha a termékben az aminő-csoportot protonfelvétel védi, az optimális védő pH a savas oldalra, rendszerint kb. 4 és 6 közé esik. Ha a védő pH^t meghatároztuk, a reakciót olyan körülményeik között kell lefolytatni, 5 ihogy a pH az optimális védő pH-értékhez minél közelebb essen. Az optimális védő pH-tól némi eltérés megengedhető. Előnyös azonban, ha a. pH 0,2 egységnél nem többel tér el az optimális védő pH-»tól, bár mintegy 0,5 egység-10 nyi eltérés megengedhető. Az optimális pH-'t az NCA eljárás technikájának felhasználásával lehet meghatározni. A pH-t az NGA eljárással kapcsolatban fentebb tárgyalt eljárásokkal lehet követni és szabályozna. 15 A TCA eljárásnak az NCA eljáráshoz viszonyított egy előnye abban áll, hogy a szabályozási technika kevésbé munkaigényes. így pl. az NCA eljárásiban a reakció rendes köirülmé-20 nyék között egy percnél irövidefofo idő alatt teljesen lejátszódik. E gyors reakció következtében gyakran nehéz követni és szabályozni a hidirogiénion-lkönioenltnáció változásait a reakció lefolyása alatt. Ezzel ellentétben a TCÁ reak-25 eiót kb. 10 perc és kb. 4 óra közötti időtartam alatt lehet lefolytatni, egyéb tényezők mellett az alkalmazott hőmérsékletektől és a specifikus reagensektől függően. í0 A TCA eljárást benső keverés mellett folytatjük le, az NCA eljárásban alkalmazottal azonos módszert követve, és így azonos előnyök is biztosíthatók. A TCA eljárásiban alkalmazott hőmérséklet-35 tartomány szélesebb, mint az NCA-eljárasban, és rendszerint kb. 0 C° és kb. 40 C° között változik, bár némileg magasabb vagy alacsonyabb .hőmérsékletek is káros hatások nélkül alkalmazhatók. Gyakran célszerű a reakciót szo-40 bahőmérsiékleten, vagyis kb. 20 C° és 30 C° közötti hőmérsékleten lefolytatni. A TCA eljárás különleges előnye, hogy lehetővé teszi a kívánt termékek nyerését szobahőmérsékleten is, melléktermékek kellemetlen felgyülemlése 45 nélkül. Ha a reagensek közül az egyik aminosav, előnyös a reakciót 0 C° és 25 C° közötti hőmérsékleten kb. 10—30 perc alatt lefolytatni. Ha a reagens glicin, az előnyös reakcióidő egy 50 nagyságrenddel, vagyis kb. 1—3 percre csökken. A peptidelk valamivel lassabban reagálnák; így az előnyös reafcciofeltetelek 15 perc és 4 óra, valamint 0 C° és 25 C° között változnak. 55 A reagenseket gyakran lehet ekvimolekuláris mennyiségben alkalmazni. Amikor a tioanhidrid hidrolízis következtében résziben elfogy, gyakran előnyös feleslegben alkalmazni, hogy így a kiindulási aminosav vagy peptid teljes 60 átalakulásiát biztosítsuk. Az optimális felesleget próbareakciókkal lehet meghatározni. A felesleg mértéke széles határok között változhat, amelyek ugyanolyan tényezőktől függenek, mint amelyeket fentebb az NCA eljárással kaposo-65 latban megtárgyaltunk. 9