157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 15 16 A találmány szerinti eljárás alapját képező együk felismerés szerint az aszpartinsav és a glutaminsav anlhidridjei meglepő módon 'felhasználhatók terminális karlboxil-csoportjaik megvédése nélkül is. A cisztin, ez a ditio-áminosav — amely szimmetrikus a-aminokarbonsaiv gyökkel rendelkezik a diszulfid-köMs mindkét oldalán — a találmány szerint sajátságos módon felhasználható két azonos polipeptid előállítására, amelyek mindegyike iciszteint, tehát csupán egy szullflhidrilncsopartot tartalmazó ^aminosavat tartalmaz. Ebben az eljárásban a cisztin szimmetrikus di-'N-koiilboxianihidridíjét reagáltatjuk egy kiindulási aminosavval, pepiiddel vagy származékkal, és így olyan szimmetrikus termieket nyerünk, amelyben a diszulfid-híd mindegyik oldalán legalább egy peptid-kötés van. Pl. a cisztin di-anihidridjét reagáltathatjuk alaninnal, bis^álanilí-eisztin nyerése céljaiból. Ezután a lánicnövelést a fent leírt módon folytatjuk pl. a leuicin és a valin anihidridjével lépcsőzetes reakcióban, s így ibis(leucin-valil-alanil)~eisztint kapunk. Amikor a kívánt molekulaszerkezettel rendelkező polipeptidat előállítottuk, a vegyületet redukáljuk, pl. hidrogénszulfiiddal, tioglilkolsavval vagy ekvivalens rédufcálószenrel a diszulfjd-íkötés felhasítása céljaiból, aminek révén a kívánt polipeptidek két azonos molekuláját alakítjuk ki, amelyek mindegyüké tartalmaz ciszteint. A javasolt példában a termék leuícil-valil^alanil-cisztein lenne. A találmány szerinti új eljárás könnyen felhasználható a hosszú szénlámcú proteinek számos analógjának az előállítására, így olyan enzimek vagy hormonok előállításaira, amelyekben a lánc közepén egy aminosav Változik. Példáiul, ha egy 20 aminosavat tartalmazó polipeptid tizedik aminosavját kell megváltoztatni olyan analógok előállítása céljából, amelyeikben az összes többi aminosav azonos szekvenciával imiarad meg, célszerű először olyan peptid-sorozaitiot készíteni, amelynek tagjai 9 aminosavat tartalmaznák, és egy második sorozatot, amely 10 aminosavat tartalmaz. Az első sorozat tagjait különböző dekapeptidekké alakítjuk különböző aminosavak N-karboxi-aminosavanhidridjeivel való reagáltatás útján. Az így előállított dekapeptidek mindegyikét kapcsolni lehet a második sorozat dekapeptiidjeivel, aminek révén 20 aminosavát tartalmazó olyan polipeptidéket kapunk, amelyekben az egyetlen változó egy aminosav a lánc közepén. Az ilyen kapcsolást a szokásos kapcsolási eljárásokkal, így fcarbdbenzoxi-módszerrel lehet megvalósítani. A találmány szerinti eljárás egy további és rendkívül nagy előnye abban áll, hogy a race» mizölódás lényegileg tökéletes ellenőrzése mellett lebet lefolytatni. A találmány szerinti eljárással nyert termékek qptikai tisztaságát könnyen meg lehet határozni pl. oly módon, hogy egy olyan specifikus enzim, így leucin-amiinopeptidáz hidrolitikus hatásának tesszük ki őket, amely enzim csupán az egyik optikai izomert támadja meg. 5 A szakirodalomban nem található említés az N-karlboxi-aminosaivanhidridek olyan tio-analógjainak heteropeptidek . szabályozott, lépcsőzetes szintézisére váló felhasználásáról, amelyeikben az éter-oxigént kén helyettesíti. Ezeket 10 az analógoikat még a nagydbb molekulasúlyú homopeptidek szabályozatlan szintézisére sem használják fél. A találmány szerinti eljárás további alapját képezi az a lényeges felismerés, hogy ezeket a 15 tio-analógokat előnyösen , lehet felhasználni heteropeptidek szabályozott, lépcsőzetes szintéziséhez. A vegyületeket az alábbi általános képlettel lehet megadni: 20 25 RCHO H-N O ahol R aminosav-maradékot jelent. E vegyületek szubsztituált tiazolid-2,i5jdionok, és aminosavak N-JtioaníhMridjeinék tekinthetők. Egyszerűség kedvéért N-itiokailboxi-Jaminosavanhid-3 ridekként említjük őket, és a szintézis módszerét TCA-eljánásként fogjuk említeni. A találmány szerinti eljárásnak ezzel a ré-40 széivel összhangban egy kiindulási aminosavat először N^tiokiarboxi-aminosaivanhidriddé alakítunk. Ezután a tioanhidridet egy másik aminosavval vagy pepiiddel reagáltatjuk N-tiokarbpxi-dipeptid vagy magasabb peptid kialakítása 45 céljából, amely detiokarboxilezés útján a kívánt vegyületté alakul. Megállapítottuk, hogy alább részletezett eljárási körülmények szerint lehetőség van e reakciók olyan szabályozására, hogy a kívánt termékeket kapjuk, zavaró mei-JTQ lélktermékék minimális képződése mellett. Hasonlóan az NCA eljáráshoz, a TCA eljárást is vizes köz-egekben folytathatjuk le. A TCA eljárást felhasználhatjuk a peptid-55 szintézis egyszerű és gyors lefolytatására vízben, szabályozott, lópésenkéhti módon, a közbenső peptid-iteimiékek elkülönítésével vagy anélkül polipeptidek, így Oxitocin, vazopreszszin, angiotenzin vagy bradikinin és protein-60 szaru anyagok, így adrenofcortikotropin és inzulin nyerése céljából. Ezen túlmenően a találmány lehetővé teszi magasabb peptidek és pro^ teinek szintézisét, ideértve olyan enzimeket és hormonokat is; amelyéket az eddig alkalmazott 65 módszerekkel nem lehetett előállítani.