157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére
1 9 legközelebb visszük az optimális védő pH értékhez. A pH változásait gyorsa« reagáló elekúródd-al lehet követni, és előnyös a pH-t önműködő titráiliással, vagy pedig semlegesítő reagens külső hozzáadásává! szabályozni. Mér ilyen rendszabályok .esetién is gyakran nehéz a pH beállítása pontosan az optimális védő értékre, minthogy nagy a reakciósebesség. Némi eltérés az optimális védő pH-tól elfogadható; előnyös .azonban, ha a pH nem változik 0,2 egységnél nagyobb méntékben az optimális védő pH-íhoz viszonyítva, ibáir 0,5 egységnyi eltérések a védő pH-tól még mlegengeidhetők. Prcíbareakció'kat lehet használni a védő pH meghatározása céljaiból, továbbá a koncentráció, hőmérséklet, idő és a moláris anhidrid-félesleg optimálás Ikörülményeinek 'meghatározása céljából, amelyek (hasznosaik a találmány szerinti eljárás kivitelezlésdkcir. Polypeptid előállítása esetén például próbareakciókat lehet lefolytatni a reaktíióelegy aliquot részeivel, hogy előállítsuk a sorozat legközelebbi magasabb tagját számos különböző pH, koncentráció, hőmérséklet, 'reakcióidő és moláris arahidrid-felssleg mellett. Az eredményeket úgy értéikeljük ki, hogy meghatározzuk a ninhidrinnel 'kialakított színt, vékoinyrétegkiromatográfiás és papírkromatográifiás eljárásokat használva különböző oldószer-komlbináiciókkal, így n-butanol-ecetsav-víz, szek.ibutanol-ecetsav-víz, piridin-izoaimilalkohol-wíz, fenol-víz és izoamiiiailkoihol-víz oldószer rendszerrel. A terméket számos színreakcióval, így pl. ninlhidrin-reakcióval lehet helyileg meghatározni. A próbáreakeiók elemzésére radioaktív nyomjelző technikát is lehet használni. Ezek az eljárások minden egyes új termék esetélben az Rf-érték könnyű meghatározását teszik lehetővé, és kényelmes módszert szolgáltatnak a termák hozamának és a melléktermékékkel való százalékos szennyezettségének meghatározására. Amikor például nagymolekulasúOyú polipeptidet állítunk elő radioaktív technika felhasználásával, minden egyes radioaktív terméket alá lehet vetni a szintézis következő lépéslének, és radioaktív mérések alapján meg lehet határozni a következő lépés hozamát különböző rsákicióikörülmiányek mellett. Ilyen okok miatt prcfoaszintéziseklben előállítjuk és fielhasznalj.uk az általánosan használt aminosavak 'mindegyikének a radioaktív N-karrfooxi-amkirasavanhidridjét. Megfelelő reakciómennyiség a prófoareakcióhoz 1,0 mmól reagens per 15 ml vizes keverék. Különösen hasznos a jelzett vegyületek sorozatának előállítása minden egyes aminosav esetében C14 szénatommal, deutériummal és mindkét izotóp elemmel jelzett alakban. Ezeket az izotópokat ismert módszerekkel külön-külön mléirhetjük. Ez a tényező a termék pontos azonosítását teszi lehetővé. 7415 10 A reakció meglehetősen gyors, és általában egy perc vagy még rövidebb idő alatt gyakorlatilag végbemegy. Ritkán van szükség arra. hogy a reakciót 5 percnél tovább folytassuk. 5 Kívánt esetben a reakció lefolyását követhetjük olyan módon, hiogy aliquot részeket az ismert hidfloxáim-próbának vetünk alá, és a reakciót addig folytatjuk, amíg a próba negatívvá nem válik, ami azt 'mutatja, hogy az N-10 -kaiibonsavanhidiriidinek lényegileg teljes menyiiyiságe lereagált. A találmány szempontjaiból legdöntőbb szabályozó feltételek közül felismerésünk szerint ] 5 nagymértékben ki lehet küszöbölni a mellékreakcióikat, és így gyakran lényegileg kvantitatív hozamokat lehet elérni, ha minden egyes reakciót alapos keverés, például gyors keverés mellett folytatunk le. Emellett a gyors keverés 20 azt is biztosítja, hogy az N-kainbonsavanhiidrid nem reagál a kiindulási anyagira nézve helyileg kimerült területeken hidrolízissel vagy polimeríizáici'óval. Az ilyen niemJ kívián ( aitas melilékreakcióik lényegeseik a fentebb (meghatározott 25 időszakokon kívül is. A gyors keverés hasonlóképpen megrövidíti a reakcióidőt az N-kairbonsavaínhidrid oldódásának megkönnyítése révén, és a karbaimlát-ter.mék bomlásának, vagyis egy olyan nem-kívánatos imellékreakciiónak az els0 karüléstét is lehetővé teszi, amely egyrészt a reakció túlszaladásához, másrészt a kiindulási anyag inaküválódásához vezetne. A reakciót rendesen 1.0 C° alatti, előnyösen 35 —5- C° és -)-i5 C° közötti hőmérsékleten folytatjuk le. Ez igen fontos a találmány szerinti eljárás szabályozása szempontjából. A víz pK értéke a hőiméinsiékliet csökkenésével párhuzamosan csökken. 0 C°-on a víz pK-értéke Itr15 . 40 Nyilvánvaló, hogy kb. 0 C°-on dolgozva a hidrosilion-lkoinicentnáció csökken anélkül, hogy egyidejűleg növekedne a Ihidragénion-koncentráció. Ez a lényeges reafcciószaibályozó körülmény segít abban, hogy minimálisra csökkent-45 sük a kiindulási Nnkartbansavanhidrid hidrolízisét iés a karibiamat közbenső termék delkarboxilezcdését. A reagenseket gyakran ekviimoílekuláiris nieny-50 nyiségéklben használhatjuk. Amikor az N-karbonsavaMhidrid- (NCA) hidrolízis következtéiben részben elfogyott, gyakran előnyös anhidridfelesleget alkalmazni annak érdekében, hogy biztosítsuk a '.kiindulási aminosav vagy peptid E5 teljes mennyiségének átalakulását a termékké. Az optimális felesleget iprábareakciókkal lehet meghatározni. A felesleget, amely széles határok között változhat, előnyös olyan ténye-6Q zűktől függően változtatni, mint az anhidrid típusa, a peptid vagy ekvivalens reagens molekulasúlya és bázicitása. A peptid-tiarmék molekulasúlyának növekedésével párhuzamosan egyre kevésbé lesz fontos az anhidrid-felesleg 65 használata, mert a kívánt -termiek fizikai és ké-5
