157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére
29 157415 30 MikroAminosav-arány Aminosav gramm/mg talált elméleti ARG 1,13 0,98 PHE 0,99 1,01 PRO 1,19 0,95 GLY 1,03 1,10 ALA 1,09 0,92 LEU 1,06 1,05 10. példa: Leuci'l-alanil-glicil-prolil-fenilalanil-arginin élőállítása A 9. példa szerinti eljárást valamivel nagyobb mennyiségekkel megismételjük. Az így előállított Nj karboxi-prolil-fenilalanil-arginint 3-as pH mellett dékarboxilezzük. A kapott oldatból közelítőleg 900 ml-t kénsavval 7-es pH-ra állítunk be, majd az oldatot vízzel 10 literre hígítjuk, és ezután 3 liter savas ciklusú IRC 50 10 15 20 gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 17,5 liter vízzel mossuk, majd 7 liter 0,5 n kénsavoldattal eluáljuk. Az eluátumot 4-literes és 3-literes frakciókra különítjük el. A 4-literes frakció pH-ját vizes nátriumhidroxid-oldattal 7-es értékre állítjuk be, majd az oldatot fagyasztva szárítjuk, és a maradékot 15 liter vízmentes metanollal extraháljuk. Az oldatot vákuumban szárazra töményítjük, és a maradékot vízben oldjuk. A tripeptidet szulfát-sóként kicsapjuk olyan módon, hogy a pH-t kénsavval 5-ös értékre állítjuk be, azonos térfogatú metanolt és kétszeres térfogatú etanolt adunk az oldathoz, majd lehűtjük. Ez a példa a találmány szerinti eljárással kapcsolatban rámutat arra, hogy milyen könynyű a közbenső termékek elkülönítése, például a közbenső termékként nyert tripeptid elkülönítése egy magasabb peptid előállítása közben. Az alábbi táblázatban megadjuk azt az eljárást, amelynek során 1,808 g prolil-fenilalanil-arginin-szulfátot a kívánt hexapeptiddé ala-25 kítunk: Kezdeti Hőmér- Idő Végső — C02 NCA Súly mg pH séklet C ° perc pH pH GLY 399 10 0 ALA 460 10 0 LEU 634 10 0 9,6 9,5 9,6 Termék GLY-PRO-PHE-ARG ALA-GLY-PRO-PHE-ARG LEU-ALA-GLY-PRO-PHE-ARG A végterméket' kromatográfiai úton különítjük el. 11. példa: Glicil-prolil-fenilalanil^arginin előállítása Összesen 4,21 g arginin^hidrokloridot felveszünk 200 ml káliumborát-pufferben, a pH-t 3,0-ra csökkentjük, miközben nitrogént buboréköltatunk át a rendszeren, hogy a széndioxidot kiűzzük, majd vizes kálíumhidroxid-oldat hozzáadásával 'a pH-t 11,0-ra állítjuk be. A reakcióelegyet gyorsan keverjük egy percen keresztül. A végső pH-10,7, és kénsiavval 3-ra állítjuk be, hogy előidézzük a dekarboxileződést. Ezután a pH-t káliumhidroxid hozzáadásával 10-re növeljük, és az eljárást 2,82 g N-karboxi^prolin-anhidriddel megismételjük. A végső pH 9,85, és ezt deíkarboxilezés céljából 3,0-ra állítjuk be. 35 A reakcióelegyet lO^szeresre hígítjuk, összesen- 10 liter térfogatra, majd átvezetjük 18 óra alatt egy olyan oszlopon, amely 800 ml IRC 50 gyantát tartalmaz. A kolonnát 4 liter vízzel mossuk 15 ml/perc áramlási sebességgel, majd 40 0,35 n kénsavoldattal eluáljuk, és az eluátumot 300 ml-es frakciókban gyűjtjük. A pozitív ninhidrid-próbát adó frakciókat fagyasztva szárítjuk, a szilárd részeket egyesítjük és metanollal mindaddig extráinál juk, amíg az extrak-45 tumok már nem adják a ninhidrin-próbát. A pozitív ninhidirin-pröbát adó extraktumokat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 4,5-ös pH érték mellett minimális mennyiségű Ihíg kénsavval felvesszük, majd 5 50 térfogat metanol és ezt követően 10 térfogat etanol hozzáadásával az anyagot kicsapjuk. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, vízben oldjuk, majd azonos metanol- és etanol^mennyiségekkel ismét kicsapjuk. A kicsapódott termék 55 glicil-prolil-fenilalanil-arginin, amelyet elkülönítünk, és metanollal és éterrel mosunk. 12. példa: Az eljárást 2,22 g N-karboxiglicinanhidriddel 60 Ciszteinil-glicil-glicil-glicin előállítása 9,5-ö;s kezdeti pH-n megismételjük. A végső pH 9,1, amelyet kénsaVval 7-re állítunk be, majd a reakcióelegyet közelítőleg 16 órán át állni hagyjuk a dekarboxileződés lefolytatása céljából. 65 Összesen 19 millimól glicint felveszünk 200 ml káliumborát-pufferben 11-es pH- mellett, 0 C°-ra hűtjük, majd hozzáadunk 19 millimól N-karboxi-glicinanhidridet.
