157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 27 28 pH-t tömény kénsav hozzáadásával 3,l-es értékre állítjuk be nitrogén jelenlétében, aminek hatására végbemegy a dekarboxileződés. A kívánt •terméket úgy különítjük el, hogy az oldatot karboxil-gyantán vezetjük át, majd a gyantáról ammóniumlhidroxid-oldattal eluáljuk. 8. példa: Leucil-valil^alanil-alann-prolil-íenilalanil-arginin előállítása Az 1. péda szerinti eljárást megismételjük, és a kromatográfáló oszlopról kapott.-3., 4., 5. és 6. firakíciót — amelyek valil-alanil-alanil-'prolil-fenilalanil-arginint tartalmaznak — egyesítjük, majd 20 ml térfogatra Ibetöményítjük. Ezt az elegyet 0 C°-ra hűtjük és 1,5 millimól N-karboxi-leucinanhidridet adunk hozzá, miközben híg káliumhidroxid-oldattal végzett önműködő titrálással a pH^t 10,5-ös értéken tartjuk. A reakció 90 másodperc alatt végbemegy. A dekarboxilezést a szokásos módon tömény kénsavval végezzük. A heptapeptid terméket elkülönítjük. Azonos terméket nyerünk olyan módon, hogy a valil-älanil-prolil-tfenilalanil-arginint tisztítjuk, majd 10,5-ös káliumiborát pufferben 0 C°^on egy perc alatt 1,5 millimól N-fcarboxi-leucinanhidriddel reagáltatjuk. Ezután delkarboxilezést végzünk olyan módon, hogy a pH-t tömény kénsavval 3,3-ra állítjuk be. A terméket az 1. példa szerinti eljárást használva kromatográfiai úton különítjük el. 5 9. példa: Leucil-alanil-glicil-prolil-fenilalanil-arginin előállítása 10 összesen 3,48 g arginint veszünk fel 200 ml 1 mólos káliumiborót-pufferben. A pH^t [kénsavval 3-as értékre állítjuk be, majd a széndioxid eltávolítása céljából a reakcióelegyen nitrogént vezetünk át. Ezután a pH-t híg vizes 15 káliumhidroxid-oldattal 11-re állítjuk be, az elegyet 0 C°-ra hűtjük, és erős keverés közben 3,84 g szilárd N-lkarboxi-fenilalanilanhidridet adunk hozzá. (Két csepp kaprilalkoholt adunk az elegyhez, hogy meggátoljuk a babzást reak-20 ció közben.) Egy perc végén a reakcióelegy pH-ja 10,9. A közbenső termékként képződött N-karboxii-fenilalanil-arginint dékaffooxilezésnék vetjük alá olyan módon, hogy kénsavval a pH-t 3-as értékre állítjuk be. Ilyen módon 25 fenilalanil-arginint kapunk, amelyeit nem különítünk el. Az alábbi táblázat a további reakciók reakciókörülményeit mutatja be a végtermék elő-30 állításáig. A különböző aminosavakat és peptideket az 1. példában használt rövidítéseikkel adjuk meg. NCA . Kezdeti pH Hőmérséklet Idő perc Végső pH — co2 pH Termék 2,82 g PRO 9,5 0 C° 1 8,9 3 PRO-PHE-AGN 2,2 g GLY 11 0 C° 1 10,4 3 GLY-PRO-PHE-AGN 2,30 g ALA 10 0 C° 1 9,6 3 ALA-GLY-PRO-RHE-AGN 3,14 g LEU 10 0 C° 1 9,8 7 LEU ALA GLY-PRO-PHE-AGN Az optimális pH-t mindegyik esetben próbareakciókkal állapítjuk meg. A végső reakcióelegy pH-ját 7-re állítjuk be, és a reakcióelegyet szűrjük. így tiszta oldatot kapunk, amelyből a kívánt terméket elkülönítjük. Ebben az utolsó lépésben a dekairboxile. zés 7-es pH mellett állás közben megy végbe. Az így kapott, összesen 335 ml térfogatú tiszta oldatot vízzel 1340 ml-re hígítjuk. A kapott oldat pH-ja 7,3-ra áll be. Az oldatot 3,3 cm belső átmérőjű oszlopban levő 400 ml savasciklusú IRC 50 típusú gyantára visszük fel 15 ml/perc adagolási sebességgel. Az oszlopot 2800 ml vízzel mossuk 20—25 ml/perc adagolási sebességgel. Ezután a gyantát 0,5 n kénsavoldattal eluáljük 15 ml/perc adagolási sebességgel. Az eluátumot 250 ml-es frakciókban gyűjtjük. A 3., 4., 5., 6. és 7. frakciókat két részletben egyesítjük (a 6. és 7. frakció az egyik és a 45 3—5. frakció a másik részlet). Mindegyik részlet pH-ját 7,5-re állítjuk be nátriumhidroxid-oldattal, majd az oldatokat fagyasztva szárítjuk. Mindegyik fagyasztva szárított szilárd részt extraháljuk négyszer 100 ml metanollal, és a 50 metanolt vákuumban eltávolítjuk. A •maradékokat vízben oldjuk, majd ismét , fagyasztva szárítjuk. Az egyesített maradékokat 50 ml vízben oldjuk, a pH-t kénsavval 3,4-re állítjuk be, majd a hexapeptid szulfát-sóját egy liter 55 etanollal kicsapjuk. A terméket úgy alakítjuk a szabad peptiddé, hogy a sót víziben oldjuk, annyi báriumhidroxidot adunk az' oldathoz, amennyi elegendő az összes szulfátnak báriumszulfátíként való kicsa-6o pasához, majd a báriumszulfátot szűrjük, és a szüredéket fagyasztva szárítjuk. A termék egy mintáját hidrolizáljuk, és a hidrolízissel nyert keveréket megelemezzük. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban ad-65 juk meg: 14