157298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás NAD-kináz enzimkészítmény előállítására

3 157298 4 májból vízzel csak acetonos feltárás után oldható ki. Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy a vizes extraktum tartalmaz ugyan adenozin^trifoszfatáz enzim-aktivitást, amely zavarja a kináz-aktivitást, azonban ez a zavaró szennyezés kiküszöbölhető a nyers enzimkészítmény speciális tisztításával. A találmány eljárás NAD-íkináz enzimkészítmény előállítására extraikeió útján, amely abban áll, hogy .aprított nyers csirkemájat vízzel vagy vizes sóoldattal ^extráhálunk. az extráktumot bázikus adszorbenssel, célszerűen protaminszulfáttal kezeljük, a szilárd fázist pufferrel extraháljuk, az extráktumot aimmóniumszulfáttal konoentnáljuk, majd puffer-oldatban 62 C° és 70 C° közötti hőmérsékleten denaturáljuk, a szennyező fehérjéket centrifugálással elkülönítjük, az oldatban maradt enzimet ammóniumszulfáttal kicsapjuk, és NAD-tartalmú oldattal szemben dializáljuk vagy célszerűen gélfiltráljuk, végül liofilizáljuk. . A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy aprított nyers csirkeimáj vizes extráktumából valamilyen bázikus fehérjével, célszerűen protaminszulfáttal kicsapjuk a hatóanyagot, majd a csapadékból 3 és 6 közötti pH-jú oldattal, célszerűen 5 pH-jú acetát-puíferral kivonjuk a hatóanyagot, amelyet kivonatiból kisózunk, célszerűen amrnóniumszülfáttal. A kisózott csapadékot "komplexképzőt, előnyösen glicilglioint tartalmazó vizes oldatban feloldjuk, majd a szennyezett fehérjék jelentős részét 65—67 C°-on végzett hődenaturálással kicsapjuk és eltávolítjuk. Az oldatban maradt hatóanyagot kisózással betöményítjük, és gélfiltrálás után liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Könnyen hozzáférhető csir'kemáj'ból olcsó eljárással teszi lehetővé az enzimkészítmény előállítását. b) Feleslegessé teszi a technikailag kényes műveleteket igénylő aeetonszáraz por készítését. c) Jól reprodukálható és lényegesen megbízhatóbb, mint a galambmájból kiinduló eljárás. d) A kapott enzimkészítnaény nem tartalmaz szennyezésként dinukleotid4)ontó enzimeket. e) A kapott enzimkészítmény lényegesen hosszabb ideig tartható el, mint a galambmájból ismert eljárással kapott enzimkészítmény. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: 1 kg friss csirkemájat a zsírtól megtisztítunk és késes homogenizátorral felaprítunk 2, liter hideg, 0,02 M koncentrációjú CaCl2

(puriss.) oldatban. A szuszpenziót jeges vízfürdőben fél órán" át állni hagyjuk, majd 10 percen át centrifugáljuk 2600 g-vel. A kapott 1700 ml felülúszóhoz 2 tér^f. hideg, 7,5-ös pH-jú, 0,04 M tris. HCl pufferban (tris.-hidroximetil-aminometán, pro. anal.) oldott 0,2 s%, prot-5 aminszulfáfcot (pro. anal.) adunk. A könnyen ülepedő csapadék felülúszóját dekantáljuk, és a maradékot • lecentrtfugáljuk. A csapadékot 2X50 ml 5,0-ös pH-jú, 0,2 M koncentrációjú . aoetát-pu'fferral extraháljuk. Az egyesített 10 extraktumokhoz litereriként 300 g szilárd ammóniumszulfátot (pro. anal.) adunk, és a szuszpenziót 2000 g-vel +4 C°-on 20 percen át centrifugáljuk. A csapadékot feloldjuk 300 ml 7,5 pH-jú, 0,1 M koncentrációjú glicilglicinben 15 (pro. anal.), és literes Erlenmeyer-lombikban 30 percen át keverjük 66 Có-os vízfürdőben. A denaturált fehérjéket oentritfugálással eltávolítjuk, így 290 ml felülúszót kapunk, amelyből 87 g szilárd ammóniumszulfáttal (1 literre 300 20 g, pro. anal.) kicsapjuk a hatóanyagot. A szuszpenziót jeges vízfürdőben fél órán át állni hagyjuk, majd +4 C°-on 2000 g-vel lecentrifugáljuk. A csapadékot 10 ml 0,01% NAD-ot tartalmazó, 7,5-ös pH-jú és 0,05 M koncentrá-25 ciójiú glicilglicinben oldjuk, az oldhatatlan frakciót kiioentirifugiálj'uk, és a felülúszót azonos pufferral mosott, 80 ml térfogatú Sephadex G—75 (Pharmacia) oszlopon gélfilráljuk. A fehérjét tartalmazó 6X5 ml frakciót egyesítjük, gO és a 30 ml oldatot liofilizáljuk. így 520 mg liofilizált port kapunk, amely Wang és Kaplan módszerével [J. Biol. Chem. 206, 311 (1954)] meghatározva milligrammonként 1,4 egység NAD-kinázt tartalmaz. 35 2. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a csirkeimáj homogenizálását 40 2 liter hideg desztillált vízben hajtjuk végre és a szuszpenzió centrifugaiadat 45 percig folytatjuk, továbbá liofilizálás előtt a 10 ml 0,01% NAD-t tartalmazó oldatot 3X100 ml 7,5-ös pH-jú, 0,05 M koncentrációjú glicilglicinnel 45 szemben dializáljuk, és a dialízis befejezésékor 0,1 ml 1%-os NAD-oldatot adunk' hozzá. Ilyen módon 570 mg liofilizált port kapunk, amely 1,02 egység/mg NAD-kinázt tartalmaz. 50 3. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a 300 ml 7,5 pH-jú oldat szelektív 55 hődenaturáMsát 69 C°-os vízfürdőben 5-perces kezeléssel hajtjuk végre. Ilyen módon 350 mg liofilizált port kapunk, amely 1,51 egység/mg NAD-kinázt tartalmaz. 60 4. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a kísérlet folyamán f elhasznált minden egyes oldalihoz 0,01 M végkoncentrá-65 cióban etiléndiamintetraecetsavat adunk, és a 2