157298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás NAD-kináz enzimkészítmény előállítására
157298 áOO ml 7,5 pH-jú oldat szelektív hődenaturáiását 62 C°-os vízfürdőben 14 órán át tartó kezeléssel hajtjuk végre. Ilyen módon 515 mg liofilizált port kapunk, amely 1,47 egység/mg NAD-kinázt tartalmaz. 5. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk •sl, azonban a hődenaturálásra 300 ml 7,5 pH-jú, 0,1 M tris./HCl puffert és 0,01 mól etiléndiamintetraecetsavat tartalmiazó oldatot használunk fel, amely glicilglicint nem tartalmaz. Ilyen módon 215 mg liofilizált port. kapunk, amely 1,04 egység/mg NAD-kinázt tartalmaz. 6. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a hődenatufálás és a denaturált fehérjék kieentrifugálása után kapott 290 ml felülúszót 3X5 liter 7,5 pH-jú, 0.01 M koncentrációjú glicilglicinnel szemben dializáljuk. A dializáit oldathoz szűrés után 1 ml 1%-os NAD-oldatot adunk és liofilizalj.uk . Ilyen módon 1270 mg liofilizált port kapunk, amely 0,48 egység/mg NADJ kinázt tartalmaz. 7. példa: 1 kg zsírmentes csirkemájat 2 liter hideg, 0,02 M koncentrációjú CaCl2 -oldatban .homogenizálunk. A szuszpenziót 30 percen át jeges vízfürdőn állni hagyjuk, majd lecentrifugáljuk. A kapott 1600 ml felülúszóhoz 480 g szilárd ammóniumszulfátot adunk és a szuszpenziót lecentri'fugäljuk. A csapadékot 300 ml 7,5 pH-jú, 0,1 M koncentrációjú glicilglicinben feloldjuk és az 1. példa szerinti módon hőkezeljük, majd a továbbiakban is az 1. példa szerinti módon járunk el. így 680 ' mg liofilizált port kapunk, amely 0,96 egység/mg NADJ kinázt tartalmaz. 8. példa: 1 kg csirkemájiat 2,.2 liter 0,035 M koncentrációjú CaCl2 -ol.datban homogenizálunk. A szuszpenziót azonnal lecentrifugáljuk. A kapott 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1850 ml felülúszóhoz 2 térf. hideg, 7,5 pH-ju 0,04 M tris./HCl pufferban oldott 0,2%-os protaminszulfát-oldatot adunk. A szuszpenzió tisztáját dekantáljuk, majd a maradékot leoentrifugáljük. A csapadékot 2X300 ml 5,0 pH-jú, 0,2 M koncentrációjú acetát-puffeiTal extraháljuk. Az egyesített extráktumokat 4X5 liter 7,5 pH-jú, 0,1 M tris./BCl puffert és 0,01 M etuéndiámintetraecetsavat tartalmazó oldattal szemben 24 óra alatt kidializáljuk. Az így kapott 580 ml dializáit oldatot 2-literes Erlenmeyer-lombikban 30 percen át keverjük 66 C°os vízfürdőben, és a továbbiakban az 1. példa szerinti módon járunk el. így 360 mg liafilizált port kapunk, amely 0,84 egység/ mg NAD-kinázt tartalmaz. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás NAD-kináz enzimkészítmény előállítására extrakció útján, azzal jellemezve, hogy aprított nyers csirkemájat vízzel vagy vizes sóoldattal extrahálunk, az extraktum fajlagos NAD-ikináz aktivitását szelektív adszorpcióval és/vagy kisózással növeljük, majd az így kapott készítményt nehéafémionokat komplexbe vivő puffer-oldatban 62 C° és 70 C° közötti, előnyösen 65—67 C° hőmérsékleten szelektív hőkezelésnek vetjük alá, adott esetben a denaturált fehérjéket elkülönítjük, és az oldatban maradt enzimeket betöményítés nélkül vagy betöményítés után tisztítjuk és végül liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az aprított nyers csirikemáj extrahálására vizes kalciumklorid-oldatot használunk:. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az extraktum szelektív adszorbcióját bázikus adszorbenssel, előnyösen protaminszulfáttal végezzük. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy nelhéztfémionokat komplexbe vivő puffer-oldatként vizes glicilglicin-oldatot használunk. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tisztítást. NAD-tartalmú oldattal szembeni dializálással vagy gélfiltrálással végezzük. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója. 7007877. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23.
