157108. lajstromszámú szabadalom • Eljárás celluláz- és hemicelluláz-aktivítású enzimkomplex kinyerésére fermentációs anyagból

157108 6 Eluáló szer MolapH Termelés ritás a megkötött anyag % -ában Na szulfát 1,0 5,9 30 Na foszfát 1,0 6,5 20 Piridin 1,0 6,5 5 Piridin: Na acetát-ecetsav 1:1 1,0 6,5 98 Kollidm: Na acetátecetsav 1:1 1,0 6,5 23 Piridin: Na acetát-ecetsav 1:1 1,0 5 25 Piridin: Na acetát-ecetsav 0,75:1 1,0 6,5 90 Piridin: Na acetát-ecetsav 1,25:0,75 1,0 6,5 95 10 15 A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az oldott állapotban levő cellulolitikus enzimet 20 szilikát-alapú adszorbensen kötjük meg, majd megszárítjuk, vagy a megkötésnél alkalmazott vegyhatásnál magasabb pH-értékek mellett szerves és/vagy szervetlen sók, az adott esetben szerves nitrogéntartalmú tercier bázis vizes olda- 25 tával az adszorbensről leoldjuk, és az oldatból ismert módon fehérjekicsapó szerekkel kinyerjük. A szilikát-alapú adszorbensen történő megkötés pH-függésére vonatkozóan azt találtuk, S0 hogy az pH 3,0—4,5 között a legnagyobb; derítőföld alkalmazásával ilyen vegyhatás mellett a fermentlé összaktivitásának már egyszeri adszorpció után is csak 15—20%-a marad vissza a fermentleben. Az. adszorpciós lépés ismétlésé- 35 vei ugyan a visszamaradó enzimménnyiség tovább csökkenthető, az első adszorpció nagy hatásfoka miatt mégis az ismétlés a gyakorlatban elenyésző jelentőségű. A találmány szerinti megoldásnak a hatékonyságára mutat, hogy az 40 említett méretű enzim megkötés már kis — a fermentlé enziimtartalmától függően 1—10%-nyi — adszorbens-mennyiséggel elérhető, ami végül is az enzim' ezzel arányos bekoncentráíását eredményezi. 45 Az eljárás további előnye, hogy szobahőmérsékleten is kivitelezhető, tehát az ismert eljárásoknál használt lehűtési műveletet nem igényli. 50 A cellulolitikus enzimek gyakorlati alkalmazásánál fontos lehet a találmány szerinti adszorpciós művelet kihasználása abból a szempontból, hogy nem szűrt fermentációs anyagból is előállítható egy fermentdús sűrítmény; 55 a fermentleben levő oldott enzimmennyiség ugyanis az adszorpciót követően a mikroorganizmus masszával és egyéb oldatlan elemekkel együtt különíthető el, és megfelelő szárítás után mint „nyers" enzimkészítmény használ- 60 ható. Ennek jelentősége abban áll, hogy egyszerű technológiával állítható elő hasznosítható táptalajrészeket is tartalmazó enzim-koncentrátum mezőgazdasági, takarmány-feltárási és takarmányozási célra. Az utóbbit az teszi le- 65 hetővé, hogy a használt szilikát-alapú adszorbens a tápcsatornában biológiailag indifferens. A találmány szerinti eljárás előnye az elució során abban is mutatkozik, hogy a leoldás körülményeinek megfelelő kiválasztásával az enzim oldatba-vitelén túlmenően akár olyan mértékű tisztítás is elérhető, hogy a termék embergyógyászati célra is alkalmassá válik. Az elucióval kinyert enzim mennyiségét és fajlagos aktivitását a közeghez tett ionok különbözőképpen befolyásolják. Az I. táblázatból látható, hogy a kationok közül az alkálifémek ionjai, anionok közül pedig a klorid, szulfát, foszfát, továbbá formiát és acetát hozzáadása befolyásolja legelőnyösebben a leoldás hatásfokát. A találmány szerint nyert eluátumból az enzim fehérje-kicsapószerek, előnyösen vízzel elegyedő szerves oldószerek hozzáadásával kicsapható és ismert módon szárítható. Tekintettel arra, hogy az adszorpciós enzim-megkötés és az ezt követő, kis (a kiindulási fermentlé térfogatának legfeljebb Vio-ét kitevő) térfogatban kivitelezhető leoldás nagymértékben csökkenti a kicsapási térfogatot, így az eljárás a férmentlevek feldolgozásánál alapvető problémát jelentő nagy térfogatokkal járó munkák nehézségeit kiküszöböli. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a cellulolitikus enzimeket tartalmazó, fermentációs anyaghoz a pH gyengén savasra való állítása után szilikát-alapú adszorbenst adunk 3—6% mennyiségben. Az adszorpció folyamán fokozatosan lesavanyódó közegből az adszorbens felületére kötött enzimet az oldatban visszamaradt anyagoktól elválasztjuk. Az így nyert enzimtartalmú anyagot vagy feldolgozzuk állattakarmányozási célra 30 °C alatt végzett szárítással, vagy pedig az enzim leoldásával embergyógyászati célra is alkalmas tisztaságú enzinikészítményt állítunk elő. Az utóbbi műveletben az eluciót vizes közegben ^alkálifémek formiát-, acetát-, klorid-, foszfát-, ill. szulfát-sójával, vagy pedig ezeknek piridinnel vagy kollidinnel képezett meghatározott elegyeivel végezzük pH 4,5—8,0 értékek között. Az alkalmazott sók, ül. velük képezhető pufferek molaritása az elució során 0,1—3,0 mól. Az így oldatba vitt enzimet előnyösen hűtött körülmények között, vízzel elegyedő szerves oldószerrel, pl. acetonnal kicsapjuk, és ismert módon szárítjuk. Az eljárással kapott termék enzimaktivltása függ a kiindulási fermentációs anyag enzimtartalmától. Különösen alkalmasnak találtuk az eljárást Aspergillus species fermentlé feldolgozására, amelyből 90—1Ö0 E/mg viszkozimetriás-, ill. 90—100 mg glukóz/mg, redukáló cukor-teszten mért hatóértékű celluláz állítható elő, de tartalmaz hemicellulázaktivitást is 2 E/mg, ill. 4 mg glukóz/mg mennyiségben. A készítmény nem toxikus, az akut LD50 egéren p.o. > 1000 mg/kg. Az anyag — mint ahogy a II. táblázat 3