156977. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
7 156977 2 Ne-BOC-L-lizil-L-valinamid Az 1. szerint kapott dipeptidszármazék 4,4 g-ját 300 ml metanolban szuszpendáljuk és 500 mg palládiumos aktívszén jelenlétében hidrogénezzük. Az eközben képződő széndioxidot egy második, nátronlúggal töltött hidrogénező edényben elnyeletjük. Kb. 2 óra múlva a hidrogénfelvétel befejeződik, és a kezdetben nem oldódó dipeptidszármazék teljesen oldatba ment. A katalizátort az oldatból kiszűrjük, és a szüredéket szárazra pároljuk. A maradék Ns-BOCL-lizil-Lnvalinamid, a további feldolgozáshoz elegendő tisztaságú. 3. Na-Z-Ns-BOC-L-lizil~(Ns-BOC)-L-lizil-L-va~ linamid 3,1 g 2. szerint kapott Ns-BOC-L-lizil-L-valinamidot 60 ml frissen desztillált dimetilformamidban feloldunk, és az oldatot 4,65 g Na-Z-Ne-BOC-L-lizin-p-nitrofenilészterrel elegyítjük. A tiszta oldatot 24 órán át 28°-on állni hagyjuk. Ezt követően a dimetilforrnamidot 40°-on 0,01 Hgmm nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot tisztítás céljából sok ecetsavval eldörzsöljük, leszívatjuk és szárítjuk. Ily módon az Na-Z-Ns-BOC-L-lizü-(N£-BOC)-L-lizil-L-valinamid tripeptidszármazékot amorf por alakjában kapjuk. O.p.: 192—195°. Szilikagél vékonyrétegen kromatografálva kloroform-metanol (9:1) rendszerben az Rf-érték=0,36, kloroformmetanol (19:1) rendszerben pedig az Rf-érték == 0,14. 4. N£-BOC-L-lizü-(Ne-BOC)-L-lizil-L-valinamid 1,0 g 3. szerint kapott tripeptidszármazékot 120 ml metanolban oldunk és 100 mg palládiumus aktívszén (10% Pd) jelenlétében hidrogénezzük, miközben a képződő széndioxidot egy másik, nátronlúggal töltött hidrogénező edényben elnyeletjük. A hidrogénfelvétel befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, és a szürleíet bepároljuk. Ily módon Nf-BOC-L-lizil-(N«BOC)-L-lizil-L-valinamid tripeptidszármazékot kapunk színtelen gyanta alakjában. Szilikagélen történő vékonyrétegű kromatografálás során az Rf-érték = 0,09 kloroform-metanol (9 : 1) rendszerben és a termék a nem hidrogénezett tripeptidszármazéktól mentesnek mutatkozik. 5. Na-Z-Ns-BOC-L-lizil-L-prolil-L-valil-glicü-(Ne-BOC)-L-üzil-(Ne-BOC)-L-lizil-(Ne-BOC)-L-lizíl-Ns-BOC)-L-lizil-vaünamid 1,71 g Na-Z-N£-BOC-L-lizil-L-prolil-L-valü-glioil-(Ní-BOC)-L-lizil-(Ne-BOC)-L-lizinhidrazidot (előállítását lásd az 1 214 242 sz. német szabadalmi leírásban) 3,1 ml 2,5 n vizes sósavat tartalmazó 30 ml frissen desztillált dimetilformamidban —20°-on keverés közben feloldunk. Ezt követően 1,55 ml 1,0 mólos nátriumnitritet csepegtetünk az oldathoz, —10°-ra felmelegítjük és ezen a hőmérsékleten 20 percig reagáltatjuk, majd 805 mg (NE-BOC)-L-IÍZÍI-(Ne-BOC)-L-lizil-L-valinamid és 625 mg trietilamin 5 ml dimetilformamidos, —10°-ra előre, 5 lehűtött oldatát hozzáadjuk, és az oldatot éjszakán át 2°-on állni hagyjuk. Ezt követően az oldatot nagyvákuumban 40° fürdőhőmérsékleten kis térfogatra bepároljuk, és a nyers nonápeptid-származékot 200 ml víz hozzáadásával 10 kicsapjuk. A kapott terméket eldörzsöljük, leszivatjuk és vízzel mossuk. 2,3 g nyersterméket kapunk. A nyers nonapeptidet ellenáramú megoszlással kloroform-toluoPmetanol-víz (5:5:8:2) rendszerben 120 fokozatban tisztít-15 juk. Az egyes frakciókat vékonyrétegű kromatografálással szilikagélen ellenőrizve (Rf-érték = = 0,26, kloroform-metanol = 9:1 rendszer) a védett nonapeptid egységes frakcióit egyesítjük. Ellenáramú megoszlás helyett a nyers védett 20 nonapeptidet metanolból kristályosítva is tisztíthatjuk. E célból a nyersterméket metanolban oldjuk és az oldatot lassan lehűtjük. Ekkor a nonapeptidszármazék tisztán, por alakjában kiválik. O.p.: 248—250°; :[w]D 2 ° = —46° (90%-os 25 ecetsavban). 6. Ns-BOC-L-lizil-L-prolil-L-valü-glicil-(Ne-BOC)-L-lizil-(N£-BOC)-L-lizil-(Nt-BOC)-L-lizil-(Ne-BOC)-L-lizü-L-valinamid 20 500 mg 5. szerint kapott nonapeptidszármazékot 50 ml metanolban szuszpendálunk és intenzív keverés közben 200 mg palládiumos akti vszén (10% Pd) jelenlétében hidrogénezzük. S5 Az eközben képződő széndioxidot egy másik hidrogénező edényben elnyeletjük. A hidrogénfelvétel befejeződése után az elegyet 50°-ra felmelegítjük, és a katalizátort kiszűrjük. A szürletet szárazra pároljuk és ily módon az Ns-40 -BOC-L-lizil-L-prolil-L-valil-glicil-(N£-BOC)-L-lizil-(Ní-BOC)-L-lizil-(N£-BQC)-L-lizil-(N£-BOC)-L-lizil-L-valinamid nonapeptidszármazékot színtelen gyanta alakjában kapjuk. A termék szilikagélen végzett vékonyrétegű kro-45 matografálással (kloroform-metanol = 85 : 15 rendszerben) a nem hidrogénezett kiindulási anyagtól mentesnek mutatkozott. 7. Na-BOC-D-szerü-L-tirozil-L-szerü-L-metionü-50 -(y-t-butü)-L-glutamin-L-hisztidil-L-fenilalanil--L-arginil-L-triptofil-glicil-(Ns-BOC)-L-Uzil-L-propü-L-valil-glicü-(Ns-BOC)-L-lizil-(Ne-BOC)-l-lizü-(Ns-BOC)-L-lizü-(Ne-BOC)-L-lizil-L-válinamtd 55 165 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(ÖtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-CH-t (lásd az 1 512 342 sz. francia szabadalmi leírást) és 150 mg H-Lys- -(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-60 -LystBOC^LySÍBOQ-Val-NHa-t 4 ml frissen desztillált dimetilformamiddal és 0,018 ml 6,0 n vizes sósavval elegyítünk. Az elegyet 50°-on 1 órán át keverjük, majd 23 mg N-hidroxiszukcinimidet és 34 mg diciklohexilkarbodiimidet 65 adunk hozzá és további 3 órán át 50°-on kever-4
