156977. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására

\ 156977 10 jük, majd további 34 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és 50°-on ismét 15 órán át keverjük. Ezt követően a nem oldódó részt kiszűrjük, és a szürletet 100 ml peroxidmentes éterbe öntjük. A finompelyhes csapadék alakjában leváló, nyers védett nonadekapeptid-származékot kiszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. A termék 150 mg-ját ellenáramú megoszlással tisztítjuk, kloroform-széntetraklorid-metanolpuffer (14 : 8 : 20 : 6) oldószerrendszerben (puffer: 29 ml jégecet és 20 g ammóniumacetát 1 liter vízben oldva, pH = 4,5). A kapott terméket az oldószerkeverék 50 ml alsó- és felső-fázisában oldjuk, és ezeknek az oldatoknak 10— 10 ml-ét a megosztókészülék első 5 csövébe töltjük (fázistérfogat 10—10 ml), majd 120 fokozatban Craig szerinti alapeljárásnak vetjük alá. Az egyes csövekben levő anyagok egységes voltát vékonyrétegű kromatografálással, szilikagélen, kloroform-metanol (75 : '25) oldószerrendszerben ellenőrizzük; a védett nonadekapeptidamid fenti rendszerben Rf = 0,28 értéket mutat. Az egységes frakciókat egyesítjük. A súlygörbe maximuma a 20. csőben van (megoszlási szám K = 0,28). 8. DSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-NH2 100 mg 7. szerint kapott védett nonadekapeptidszármazékot 3 ml 90%-os trifluorecetsavban feloldunk és az oldatot 26°-on 1 órán át állni hagyjuk. Ezt követően az oldatot 100 ml peroxidmentes éterbe öntjük, a finom pelyhek alakjában leváló csapadékot kiszűrjük, éterre] mossuk, és exszikkátorban nátriumhidroxid felett szárítjuk. Ecetsavas sóvá való átalakítása céljából a terméket 3 ml 5%-os ecetsavban oldjuk, 10 ml Merck No. II., gyengén bázisos, acetát-alakban levő ioncserélőt tartalmazó oszlopon szűrjük, majd 5%-os ecetsavval mossuk, míg az eluátum az ultraibolya spektrumban 280 m/x-on abszorpciót már nem mutat. Az eluátumot liofilizáljuk, ekkor a H-D~Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-ffis-Phe-Arg-Tiy-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-NH2 nonadekapeptid ecetsavas sóját gyengén sárgás, könnyű por alakjában kapjuk. A termék 6 n HCL-el (24 óra, 110°-on) végzett teljes hidrolízis és kvantitatív aminosavanalízis során a várt moláris aminosavarányt mutatja. Alumíniumoxidon végzett vékonyrétegű kromatografálás során a nonadekapeptidamid a következő Rf-értékeket mutatja: Rf101 = 0,50;

Rf52A

= 0,25. 2. példa. 1. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nleu-Glu-(Otbu)-His--Phe-Arg-Try-Gly-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Val-NH2 500 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nleu-Glu-(OtBu)--His-Phe-Arg-Try-Gly-CH-t (előállítását lásd a 709 454 sz. belga szabadalmi leírásban) es 420 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Val-NH2-t 20 ml 5 frissen desztillált dimetilformamidban szuszpendálunk, és keverés közben 0,3 ml 1 n vizes sósavat hozzáadunk. Szobahőmérsékleten végzett 1 órán át tartó keverés után 75 mg N-hidroxiszukcinimidet és 100 mg diciklohexilkarbo-10 diimidet adunk az elegyhez, majd 45°-ra felmelegítjük és 2y2

órán át keverjük. Ezt követően további 50 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá, és további 12 órán át 45°-on keverjük, majd az oldhatatlant kiszűrjük, a szür-15 letet nagyvákuumban 40° fürdőhőmérsékleten kis térfogatra bepároljuk, és a védett nonadekapeptid-származékot sok éter hozzáadásával kicsapjuk. A porszerű csapadékot eldörzsöljük, leszivatjuk és szárítjuk. A kitermelés 950 mg 20 nyerstermék, amely még némi diciklohexilkarbamidot tartalmaz. A terméket közvetlenül továbbdolgozzuk. 2. H-D-Ser-Tyr-Ser-Nleu-Glu-His-Phe-Arg-Try-25 Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-NH2 500 mg 1. szerint kapott védett nonadekapeptidamid-nyersterméket jéghűtés mellett 10 ml S0 90%-os trifluorecetsavban feloldunk, és az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a gyengén ibolyáskék színű oldatot 200 ml éterbe öntjük, a pelyhes csapadékot eldörzsöljük, leszivatjuk, éterrel mossuk, és ex-85 szikátorban nátriumhidroxid felett szárítjuk. Ekkor 460 mg nyers nondekapeptidamid-trifluoracetátot kapunk. A trifluorecetsav-ionok eltávolítása céljából a terméket 10 ml 5%-os vizes ecetsavoldattal elegyítjük, szűrjük, és a 40 tiszta oldatot 20 ml gyengén bázisos, acetátalakú ioncserélőt (Merck, Nr. II.) tartalmazó oszlopon bocsátjuk keresztül. Az oszlopot 5%-os vizes ecetsavval (40 ml) mossuk. Az egyesített eluátumokat vákuumban 40° fürdohőmérsékle-45 ten szárazra pároljuk, a maradékot kevés vízben oldjuk és liofilizáljuk. Tisztítás céljából a terméket 10 ml ammóniumacetát-oldatban (0,3 mól, pH = 6,5) oldjuk és ugyanezzel az oldószerrel készített „CM-Sephadex" C-25 (Phar-50 macia cég, Uppsala) oszlopra (2,5 X 40 cm) viszszűk és 500 ml 0,3 mólos és 500 ml 5,0 mólos (pH = 6,5) lineáris grádiensü ammóniumacetát-oldattal eluáljuk. Az eluálást regisztráló ultraibolya spektrofotométerrel ellenőrizzük. Az 55 oldatból 5-5 ml-es frakciókat veszünk. A kb. 3 mólos ammóniumacetát-koneentrációnál eluált főfrakciókat egyenként bepároljuk, és az ammóniumacetát-tartalmukat 0,1 Hgmm nyomáson, 40° fürdőhőmérsékleten szublimálva eltá-60 volítjuk. A peptidmaradékok tisztaságát vékonyrétegü kromatografálással alumíniumoxid-lemezen (Camag cég gyártmánya) a 101. rendszerben el-65 lenőrizzük. Az egységes frakciókat kevés víz-