155880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív polipeptidek és intermedierek szintézisére

155880 33 pentapeptidésztert kapunk. Rj3

0,65. Op.: 170— 173 C°. C10

H

62!

N

6

O

14

(850,97). számított: C: 56,4% H: 7,3% N: 9,9% talált: 55,8 7,4 9,8 7. lépés Z-Val-Lys;(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Prc-As,p(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(NH2

). -Ser-Ala-OBu-' 1,2 g (1,4 mmól) védett pentapeptidésztert (12. példa, 6. lépés) 50 ml etanolban oldva csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk, majd a szűrés és bepárlás után kapott maradékot, 1,68 g (1,4 mmól) védett oktapeptidből készült N-hidroxinukcinimidészterrel (Rí—317-es Magyar Szabadalom) 10 ml dimetilformamidban oldjuk. Másnap a reakcióelegy bepárlásával nyert maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, a szűrőn 8%-os NaHC03

oldattal és vízzel mossuk. 2,25 g (85%) nyers védett tridekapeptidésztert kapunk. R/3

0,55. 8. lépés Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N02

)-Arg(N0

2

)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-ProHAsp(OBuO-Ala-Gly-GluíOBuO-AspíOBu")-Glu(NH2

)-Ser-Ala-OBu' 50 ml etanolban oldott 2,25 g (1,19 mmól) védett tridekapeptidet (12. példa, 7. lépés) csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk, majd az oldat szűrése és bepárlása után visszamaradt tridekapeptidésztert 1,44 g (1,06 mmól) védett pentapeptid pentaklórphenilészterrel (7. példa, 3/b. lépés) 5 ml dimetilformamidban feloldjuk. Egy napi állás után az oldatot csökkentett nyomáson besűrítjük és a maradékot vízmentes éter alatt megszilárdítjuk, szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. A nyers terméket (2,75 g; 91%) 10 ml etilacetátban oldjuk, 60 g szilikagélből készült 2 cm átmérőjű oszlopra visszük és etilacetát : piridin : ecetsav : víz = 120 : 10 : : 3 : 5,5 arányú elegyével eluáljuk. 20 percenként 3 ml-es frakciókat szedünk; a tiszta főtermék a 129—141-es frakciók bepárlásával 0,3 g védett oktadekapeptid nyerhető. R/2 0,35. 9. lépés Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBuO-Ala-Gly-Glu(OBu')-Asp(OBuf

)-Glu(NH,)-Ser-Ala-OBu'• 3 HC1 300 mg védett oktadekapeptidésztert (12. példa, 8. lépés) 20 ml 80%-os ecetsavban oldva csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk. A reakcióelőrehaladását vékonyréteg kromatogramon ellenőrizzük. A reakció befejeződése után, az oldatot leszűrjük, vákuumban be-31 pároljuk és a maradékot vízmentes étérreL eldörzsöljük, szűrjük, szárítjuk. A kapott oktadekapeptidacetát 7 ml 0 C°-os 0,2 N-sósavban 5 oldjuk és 7 ml telített nátriumklorid oldattal kicsapjuk. Szűrjük telített NaCl oldattal mossuk, szárítjuk, 144 mg (50%) oktadekapeptidtrihidrokloridot kapunk. R/1

0,40. 10 60 10. lépés BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BQC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-15 -Tyr(BuO-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu')J

Asp(OBu0-Glu(NH

2

)-Ser-Ala-OBu'-3 HCOOH 120 mg (0,060 mmól) védett tetradekapeptidet, 20 (1. példa, 10. lépés) 144 mg (0,053 mmól) oktapeptidészter-triklórhidrátot, (12. példa, 9. lépés) 97 mg (0,36 mmól) pentaklorphenolt; 25 mg (0,12 mmól) diciklohexilkarbodiimidet 0,4 ml dimetilformamidban feloldunk. Egy napi állás 25 után 0,4 ml dimetilformamidban oldott 0,06 ml (0,43 mmól) trietilamint adunk hozzá és további egy napot állni hagyjuk. Ekkor a reakcióterméket peroxid mentes éterrel kicsapjuk, szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. A kapott 270 mg íü nyers terméket 8 g szilikagélből készült oszlopon etilacetát : piridin : hangyasav : víz = 60 : 20 :6 : : 5,5 arányú elegyével kromatografáljuk, 20 percenként 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk. A főterméket a 109—135-ös frakciók bepárlásával 35 nyerjük. 24 mg (10%) védett dotriakontapeptidet kapunk. R/? 0,2. 11. lépés 40 H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe4Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Glu(NH2

)-Ser-Ala—OH (humán ACTH

1—^32) 17 mg védett dotriakontapeptidet 0,5 ml 90%-45 os triíluorecetsavban oldunk, majd 15 perces állás után az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot 0,5 ml vízben oldjuk és ismét bepároljuk. A vizes oldást és bepárlást még egyszer megismételjük, végül a ma-50 radékot 0,5 ml vízben oldjuk és 8 ml acetát ciklusban levő Amberlite IRA—400--as gyantán folyatjuk, át 10 ml vízzel mossuk. Az egyesített vizes oldatokat liofilizáljuk. Termelés 11 mg. (80% szabad dotriakontapeptid. R/8

0,45. Aminosavanalízis: Lys 4,16 (4); Arg 2,98 (3); 55 His 1,5 (1); Asp 2,0 (2); Ser 3,4 (3); Glu 3,5 (3); Pro 3,2 (3); Gly 3,5 (3); Ala 1,6 (2); Val 3,2 (3); Met 1,1 (1); Tyr 2,1 (2); Phe 1,3 (1). Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás a (II) általános képletű kortikotropin-fragmensek Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-65 -Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Q (II) — e képletben Q az alábbi jelentésű lehet: 17