155873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított amiloglukozidáz-készítmények előállítására

3 155873 4 A 3 108 ©28 sz. amerikai szabadalmi leírás szerint a transzklukozidáz szelektíven inaktiválható, az enzim-oldat 9—11 pH-értéken való 1/2—24 órai kezelése útján. E módszernek is azonban különböző hátrányai vannak. A ferment levek csaknem 'mindig tartalmaznak bizonyos mennyiségű át nem alakult cukrot és fehérjét, valamint ezekből származó lebontási termékeket, amelyekből 9—1.1 pH-értéken egy Maillard-típusú reakció útján barna színű kondenzációs termékek képződnek; ezek hátrányosak a dextróz termelése szempontjából. Emellett ehhez a tisztítási módszerhez eléggé nagy mennyiségű lúgra van szükség, minthogy a fermentáció végén a fermentációs közeg ,pH-értéke eléggé nagy mértékben csökkenni szokott, kb. 2,5—i3,5 értékre. Végül számottevő mennyiségű só is szennyezi a végterméket, amit azután a dextróz előállítása során ismét el kell távolítani. Ismeretes, hogy az enzimek erősebben savas közegben, pl. pH = 2 alatt általában igen instabilak. Ismert kivételt képez e szempontból a pépszín. A transzglukozidázról is megállapították — vö. Chem. Abstracts 63, 16678a (1965) — hogy az szintén meglehetősen stabil ezen a pH-értéken. Meglepő módon sikerült oly eljárást találnunk az amiloglukozidáz-készdtmények tisztítására, amelyet az jellemez, hogy a tisztítandó enzim vizes oldatát 2,5 alatti pH-értéken inkubáltatjuk. Ilyen módon a transzglukozidáz inaktiválható, anélkül, hogy az amiloglukozidáz aktivitása észrevehető módon csökkenne. Ez a módszer egyszerű és olcsó, minthogy csupán annyi Sav hozzáadására van szükség, amennyi a kívánt pH-érték elérésére elegendő; további adalékok nem lényegesek. Az eljárás következtében képződő só mennyisége lényegesen kisebb, mint a transzglukozidáz (alkalikus elbontása esetén, emellett igen nagy előny, hogy nem képződnek színezett kondenzációs termékek. Meglepő módon azt találtuk, hogy az amiloglukozidáz 2 körüli pH-értéken szobahőmérsékleten 24 órát méghaladó ideig is stabil. A kívánt alacsony pH-érték erős savaik alkalmazásával állítható be. Szükséges természetesen, hogy olyan savat alkalmazzunk érre a célra, amely nincsen károsító hatással az enzimre. Ezért nem alkalmasak e célra felületaktív tulajdonságokat mutató savak. Jól használhatók pl. a sósav, kénsav, foszforsav, citromsav, oxálsav, ecetsav és hangyasav a találmány szerinti eljárásban. A találmány szerinti eljárással készített amiloglukozidáz-készítmények igen erős tulajdonságokat mutatnak a dextróz keményítőből történő gyártása szempontjából; a műveletnél a pH-értéket kívánt esetben oly szintre állíthatjuk, amelyen ez az enzim a legnagyobbfokú stabilitást mutat. Az így előállított enzimmel végzett kísérleteink során mindegyik készítménynél határozott javulást tapasztaltunk az elérhető maximális D. U.-érték (meghatározását lásd alább) szempontjából. Minden esetben 98— 98,5%-os D. U.-értékek voltak elérhetők. A transzglukozidáz szelektív elbontásának módszere akár a fermentációs folyadékokra — a 5 mikroorganizmus jelenlétében vagy annak eltávolítása után — akár enzimkészítmény-koncentrátumokra alkalmazható. A kezelés abból áll, hogy a kultúra-folyadékhoz (az enzimet termelő mikroorganizmus le-10 lenlétében vagy anélkül) vagy a kultúra-folyadék koncentrátumához, keverés közben savat adunk a kívánt alacsony pH-érték eléréséig. A kultúra-folyadékot ill. enzimkoncentrátumot kb. 15 perctől 24 óráig tartó ideig — a pH-értéktől 15 függően — ezen a pH-értéken tartjuk, előnyösen 40 C° alatti hőmérsékleten. Az alkalmazott pH-érték, az inkubációs időtartam és az inkubációs hőmérséklet között bizonyos kölcsönös összefüggés áll fenn. A készítményben jelen-10 levő transzglukozidáz gyorsabban inaktiválódik alacsonyabb pH-érték és magasabb hőmérséklet esetén. Gyakorlati szempontból az 1,9 körüli pH-érték bizonyult a legelőnyösebbnek. A hőmérséklet elvben akár 0 C° alatt is lehet, 25 ha kiindulóanyagként nagymértékiben koncentrált amiiloglukozidáz-készítményt alkalmazunk. Emellett azt találtuk, hogy ha a készítmény. ben a só-koncentráció nagyobb, amint ez pl. az enzim-konoentrátumok esetében fennáll, a 30 transzglukozidáz inaktiválódása és az amiloglukozidáz inaktiválódása is, gyorsabban halad előre; ezért az amiloglukozidáz-aktivitás csökkenésének elkerülése érdekében előnyös, ha enyhébb körülményeket, pl. rövidebb inkubá-35 ciós időt, magasabb pH-értéket vagy alacsonyabb hőmérsékletet alkalmazunk. Olyan esetekben, amikor egy vagy több ilyen só, mint az ammóniumklorid, nátriumklorid, kalciumklorid vagy . magnéziumfoszfát koncentrációja 0,5 40 mól körül van, az inikubációt előnyösen szobahőmérsékletén végezzük, 6 óra hosszat, 2,4 pH-értéken. Ha a pH-érték, inkubációs időtartam és inkubációs hőmérséklet megfelelő kombinációját 45 előnyösen választjuk meg, az eredetileg jelen volt trahszglukozidáz-aktivitás 90%-nál nagyobb mórtékben elpusztítható, míg az amiloglukozidáz-aktivitásban csak igen csekély, legfeljebb 5%-os veszteség következik be. A leg-50 jobb eredményeket akkor érjük el, ha az inkubáltatást kb. 24 óra hosszat, 1,9 körüli pH-értéken és szobahőfokon végezzük, kiindulóanyagként kultúra-folyadéikokot alkalmazva. Figyelembe kell venni azt is, hogy az ami-55 loglukozidáz-aktivitásban bekövetkező veszteség egy része a transzglukozidáz inaktiválódásának tulajdonítható, minthogy ez utóbbi enzim is képes a keményítő lebontására '(vö. Arch. Bioch. Biophys. 93, 43, 1961), ezért a 60 transzglukozidáz is hozzájárul az alábbi példában leírt módon meghatározásra kerülő amiloglukozidáz-aktivitáshoz. Az enzimkészítmény a fenti módon történő kezelés után a szokásos módon dolgozható fel 65 tovább, miután a készítmény pH-értékét oly o